王軍偉，蔣彩虹，宋志美，張 麗，王 魯，王元英，劉貫山*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草類(lèi)作物質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

誘變育種是人為利用物理或化學(xué)因素來(lái)處理種子、植株、組織、細(xì)胞或花粉使其基因型產(chǎn)生遺傳變異，從中選擇培育新品種的方法[1]。物理誘變應(yīng)用較多的是輻射誘變，即用 γ射線、β射線、χ射線、中子等物理因素誘發(fā)變異。其誘因是高能射線造成基因突變、染色體結(jié)構(gòu)變異?；瘜W(xué)誘變是用化學(xué)誘變劑如甲基磺酸乙酯（Ethyl Methane Sulfonate, EMS）、硫酸二乙酯等烷化劑或堿基類(lèi)似物等處理植物材料，以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變，從而引起形態(tài)特征的變異，然后根據(jù)育種目標(biāo)，對(duì)這些變異進(jìn)行鑒定、培育和選擇，最終育成新品種。EMS由于其操作簡(jiǎn)便，成本較低，誘變效果具有一定專(zhuān)一性和破壞性較小，誘變頻率高，突變性狀多為顯性基因控制，易于篩選[2]，染色體畸變相對(duì)較少[3]等優(yōu)點(diǎn)，被有效用于各種作物的誘發(fā)突變育種，已育成的水稻、小麥、大麥和大豆[4]等突變體達(dá)2250個(gè)[5]。目前，關(guān)于EMS處理煙草的誘變育種研究報(bào)道還不多，陳廷俊等[6]利用0.3% EMS處理煙草Burley18的花培單倍體幼苗心葉，并接種 CMV，結(jié)合綠島組織培養(yǎng)技術(shù)，篩選出抗CMV的細(xì)胞突變系R2和R3。Medrano H等[7]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)0.1%濃度處理1 h和0.05%濃度處理1～2 h的煙草花藥，對(duì)提高花粉脫分化小植株的數(shù)量最有效。

本試驗(yàn)以EMS作為誘變劑，通過(guò)探討EMS對(duì)煙草種子發(fā)芽率、根長(zhǎng)等性狀的誘變效應(yīng)，以期為開(kāi)展煙草種子化學(xué)誘變研究，構(gòu)建煙草突變體庫(kù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為烤煙主要品種：中煙 100、紅花大金元、K326、云煙 97、云煙 87。種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所種質(zhì)資源庫(kù)提供。EMS誘變劑購(gòu)自SIGMA公司，規(guī)格為5G。

1.2 處理濃度與方法

處理濃度分別為0（CK）、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%和1.3%。處理方法是將pH 6.5的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（Na2HPO4·12H2ONaH2PO4·H2O）[8]作為溶劑，配制濃度為 0（CK）、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%和1.3%的EMS溶液（V/V）。稱(chēng)取供試種子各1 g，用純水浸種4 h。用濾紙吸干種子表面的水后，將種子分別加到裝有500 μL上述濃度EMS溶液的EP管中，放置于26 ℃、110 rpm的搖床內(nèi)，誘變處理16 h。誘變處理后，用pH 6.5的0.01 mol/L磷酸緩沖液潤(rùn)洗，每隔0.5 h換一次磷酸緩沖液，洗3次后用長(zhǎng)流自來(lái)水沖洗2 h左右。然后將種子點(diǎn)播于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理重復(fù)4次，在26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第14天調(diào)查發(fā)芽率[9]，第30天統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)。發(fā)芽率/%=（14 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%；相對(duì)發(fā)芽率指處理的發(fā)芽率/對(duì)照的發(fā)芽率。相對(duì)根長(zhǎng)指處理的根長(zhǎng)/對(duì)照的根長(zhǎng)。在不同濃度EMS處理烤煙種子后，以相對(duì)發(fā)芽率為0.5時(shí)的EMS處理濃度即半致死濃度（Lethal concentration 50, LC50）為標(biāo)準(zhǔn)，探究EMS的適宜處理濃度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)試驗(yàn)中的種子發(fā)芽率和種苗根長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果用 SPSS 11.5[10]及 SAS 9.1[11]數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 EMS對(duì)烤煙發(fā)芽率的影響

半致死濃度（LC50）指處理后種子或植物的某一器官成活率為對(duì)照50%的處理濃度。一般以半致死濃度為基準(zhǔn)，通過(guò)增加或降低試驗(yàn)劑量以選擇適宜處理濃度[12]。由表1和圖1可以看出，與CK相比，全部 EMS處理對(duì)煙草種子的發(fā)芽率均有較大影響。不同品種對(duì) EMS的敏感性不同，但總趨勢(shì)都是隨著EMS濃度的升高，相對(duì)發(fā)芽率直線下降。在0.1%～0.5%濃度區(qū)間內(nèi)隨EMS處理濃度的升高，發(fā)芽率下降的幅度較小，而在0.7%～1.3%濃度區(qū)間內(nèi)隨 EMS處理濃度的升高，發(fā)芽率下降的幅度較大。5個(gè)品種的下降幅度不同，K326下降幅度最小，中煙100、紅花大金元、云煙87次之，云煙97下降幅度最大。當(dāng)EMS濃度達(dá)1.3%時(shí)，發(fā)芽率全部為0，說(shuō)明5個(gè)烤煙品種的致死濃度均為1.3%。

差異顯著性分析表明，同一烤煙品種不同EMS濃度的發(fā)芽率間差異顯著，不同烤煙品種同一EMS濃度的發(fā)芽率間也有顯著差異（CK和1.3%EMS濃度除外），而且前者的差異程度大于后者，這說(shuō)明EMS濃度是造成供試種子發(fā)芽率變化的主要因素，但存在有基因型差異。

表1 不同品種經(jīng)EMS處理后烤煙的發(fā)芽率 %Table1 Germination rate of different flue-cured tobacco varieties treated by various EMS concentrations

圖1 不同濃度EMS處理后供試品種的相對(duì)發(fā)芽率Fig.1 Relative germination rate of various cultivars treated by different EMS concentrations

通過(guò)逐步回歸分析，獲得了5個(gè)烤煙品種發(fā)芽率隨EMS濃度變化的回歸方程（表2）?？梢钥闯觯l(fā)芽率與 EMS濃度呈顯著負(fù)相關(guān)。由回歸方程可以計(jì)算出，中煙100、K326、紅花大金元、云煙87和云煙 97的 EMS LC50分別為 0.49%、0.52%、0.43%、0.35%和0.35%。從圖1中也可以直觀地看出，云煙87和云煙97的EMS LC50是一致的，但比中煙100、K326和紅花大金元的低，其中K326的最高。由此可以認(rèn)為，供試烤煙品種對(duì) EMS的敏感性由大到小依次為云煙 87=云煙 97＞紅花大金元＞中煙 100＞K326。

表2 5個(gè)烤煙品種的發(fā)芽率和EMS濃度的回歸方程Table2 Regression equations between germination rate and EMS concentrations for five flue-cured tobacco varieties

2.2 EMS對(duì)烤煙種苗根長(zhǎng)的影響

由表3和圖2看出，濃度為0.1%的EMS對(duì)各品種種苗根長(zhǎng)均有促進(jìn)作用。中煙100、K326、紅花大金元、云煙97、云煙87的種苗根長(zhǎng)分別比CK增長(zhǎng)了6.77%、4.74%、5.37%、2.52%、1.18%。隨著 EMS濃度進(jìn)一步提高，根長(zhǎng)受到抑制，且損傷程度隨著 EMS濃度的逐步增加而加大。其中隨EMS濃度增大，K326的根長(zhǎng)與CK相比減短最小，中煙100、紅花大金元、云煙87次之，云煙97減短最大。

表3 不同濃度EMS處理后供試品種種苗根長(zhǎng) cmTable3 Root lengths of various cultivars treated by different EMS concentrations

圖2 不同濃度EMS處理后5個(gè)烤煙品種的種苗相對(duì)根長(zhǎng)Fig.2 Relative root lengths of five flue-cured tobacco varieties treated by different EMS concentrations

雖然同一品種不同 EMS濃度的種苗根長(zhǎng)之間以及不同品種同一 EMS濃度（CK、1.1%和1.3%EMS濃度除外）的種苗根長(zhǎng)之間均達(dá)到顯著差異，但根長(zhǎng)的差異程度要小于發(fā)芽率。通過(guò)逐步回歸分析，也獲得了5個(gè)烤煙品種根長(zhǎng)隨EMS濃度變化的回歸方程，種苗的根長(zhǎng)與 EMS濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（表4）。

表4 5個(gè)烤煙品種的種苗根長(zhǎng)和EMS濃度的回歸方程Table4 Regression equations between root length and EMS concentrations for 5 flue-cured tobacco varieties

3 討 論

目前，煙草誘變育種多采用γ射線[13]、離子注入[14]等物理方法，關(guān)于煙草化學(xué)誘變特別是 EMS誘變處理的報(bào)道較少。本試驗(yàn)選取5個(gè)烤煙栽培品種中煙 100、紅花大金元、K326、云煙 97、云煙87進(jìn)行不同 EMS濃度處理。結(jié)果表明，在0.1%～1.3%處理的濃度范圍內(nèi)，EMS對(duì)種子的發(fā)芽率主要呈抑制作用。以半致死濃度為選擇標(biāo)準(zhǔn)，確定了 EMS誘變烤煙不同品種的適宜濃度為0.35%～0.52%，致死濃度均為 1.3%。它們對(duì) EMS的誘變敏感性順序?yàn)樵茻?87=云煙 97＞紅花大金元＞中煙 100＞K326。Julio E 等[15]采用白肋煙（BB16NN）為材料，以種子處理后7 d的發(fā)芽勢(shì)降低25%～40%為篩選條件，選擇的EMS適宜處理濃度為0.6%和0.8%。史躍偉等[16]以烤煙（K346、NC82和云煙 85）為材料，得出 EMS適宜的誘變濃度為0.35%，且3個(gè)品種對(duì)EMS的誘變敏感性順序?yàn)樵茻?5＞K346≈NC82。本試驗(yàn)得到的烤煙適宜EMS誘變濃度比擬南芥的適應(yīng)濃度0.2%[17]要高，與大豆的適應(yīng)濃度 0.4%[18]接近，比小麥的適應(yīng)濃度0.9%或1.0%[19]和水稻的適應(yīng)濃度1.5%[20]的要低的多，與史躍偉等[16]得到的烤煙 EMS誘變適宜濃度0.35%接近，但比其稍高。因此，在對(duì)植物種子進(jìn)行處理時(shí)，不同種植物之間，同種植物不同類(lèi)型（例如烤煙和白肋煙）之間以及同種類(lèi)型（例如烤煙）不同品種之間 EMS誘變的適宜濃度以及對(duì)EMS的敏感性均存在顯著差異。

通過(guò)差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，同一烤煙品種不同EMS濃度的發(fā)芽率間差異顯著，說(shuō)明EMS濃度是影響烤煙種子發(fā)芽率的主要因素；而不同烤煙品種同一 EMS濃度烤煙種子的發(fā)芽率也有顯著差異（CK和1.3%EMS濃度除外），可見(jiàn)品種也是影響EMS處理種子發(fā)芽率的關(guān)鍵因素。但是前者的差異程度大于后者，因而在進(jìn)行 EMS誘變處理時(shí)，針對(duì)不同的煙草品種類(lèi)型要分別摸索其適宜的 EMS濃度。

試驗(yàn)表明，低濃度處理對(duì)種子發(fā)芽率和種子根的伸長(zhǎng)有促進(jìn)作用，高濃度處理對(duì)種子發(fā)芽率和種子根的伸長(zhǎng)均呈顯著抑制作用。原因可能是低濃度的 EMS能促進(jìn)細(xì)胞的呼吸作用，生理代謝增強(qiáng)，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)分化；而高濃度的 EMS則對(duì)煙草的生理代謝有抑制作用，且濃度越高代謝受到的抑制作用越強(qiáng)。

烤煙 EMS誘變適宜濃度的獲得為創(chuàng)建煙草突變體庫(kù)奠定了基礎(chǔ)，后續(xù)研究也得到了許多不同表型的突變體。這些突變材料可用于克隆和闡明煙草的重要功能基因，是煙草功能基因組學(xué)研究中不可缺少的重要組成部分[21]。還可直接育成煙草新品種或創(chuàng)造新的煙草種質(zhì)資源，極大豐富煙草的遺傳資源。

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