季學(xué)軍，張 國，王道支，劉國順

（1.安徽皖南煙葉有限責(zé)任公司，安徽 宣城 242000；2.國家煙草栽培生理生化研究基地，鄭州 450002）

特色煙葉是指在品質(zhì)特征上有不同于其他煙葉特點(diǎn)的煙葉，這些特點(diǎn)能為工業(yè)所接受，并且在卷煙配方中所利用，突出表現(xiàn)在香型風(fēng)格突出，香氣質(zhì)好，香氣量充足等方面[1]。自上世紀(jì)60年代起，我國烤煙被劃分為濃香型、清香型、中間香型三大香型，安徽皖南煙區(qū)煙葉屬濃香型，同時(shí)具有與津巴布韋煙葉相似的焦甜香風(fēng)格特征。

烤煙中香氣成分的種類、含量及其比例是構(gòu)成特色煙質(zhì)量的物質(zhì)基礎(chǔ)。烤煙中香氣物質(zhì)的種類很多，其前體物質(zhì)可分為類胡蘿卜素和非環(huán)萜烯、類黑松烷巨環(huán)萜烯、賴百當(dāng)類雙萜烯以及棕色化反應(yīng)產(chǎn)物等。特色煙的質(zhì)量形成除與品種的種性有關(guān)外，更與生態(tài)環(huán)境和農(nóng)藝措施有關(guān)。煙葉的香氣前體物質(zhì)大多數(shù)屬于次生代謝產(chǎn)物，并不是其生長繁殖所必須的，可能主要是其對(duì)非生物環(huán)境因素脅迫的應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物。煙株生長過程中，受到的非生物環(huán)境脅迫作用分別有高溫或低溫、干旱或淹水、強(qiáng)光、營養(yǎng)缺乏等，導(dǎo)致煙株體內(nèi)活性氧積累。植物體內(nèi)存在著酶促和非酶促兩類防御活性氧的保護(hù)系統(tǒng)，前者與煙葉香氣關(guān)系不大，而后者可能與煙葉香氣物質(zhì)的合成有密切關(guān)系，煙葉合成較多的還原性物質(zhì)如類胡蘿卜素、酚類、還原糖和氨基酸等，這些物質(zhì)是煙葉香氣的前體物質(zhì)[2-9]。因此，適度的氧化脅迫可能有利于煙葉中香氣前體物質(zhì)的合成與積累，有利于特色煙質(zhì)量的形成[10]。

自 2003年在皖南華陽河流域部分植煙地塊發(fā)現(xiàn)具有津巴布韋煙葉特有的焦甜香風(fēng)格的煙葉后，經(jīng)在該煙區(qū)主要土壤類型（沖積砂壤土、河灘砂壤土、粉砂土和水稻土）植煙，其他生態(tài)條件如光、肥、氣和溫等基本相同，能夠穩(wěn)定表現(xiàn)出焦甜香風(fēng)格的主要是沖積砂壤土、河灘砂壤土和粉砂土等砂性較強(qiáng)的土壤，其機(jī)理值得深入研究。本試驗(yàn)通過對(duì)皖南煙區(qū) 4種土壤類型植煙煙葉中活性氧的產(chǎn)生、清除機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，以探討活性氧代謝與特色煙形成的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在皖南沖積砂壤土、河灘砂壤土、沖積粉砂土和水稻土4種土壤上進(jìn)行，供試品種為云煙87，按當(dāng)?shù)靥厣珒?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)管理。移栽前后每種土壤選取 20株煙進(jìn)行葉位標(biāo)記，每隔2 d調(diào)查1次，選取第18片真葉代表中部葉。自葉片長出5 mm計(jì)為葉齡第1天，分別采集15、30、45、60 d葉齡的中部葉片于冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，剪去葉片周圍的邊葉，剪取6～8葉脈之間的葉剪碎后混勻，進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目和方法

煙葉中總抗氧化能力（TAOC）、超氧陰離子自由基(O-2)含量和羥自由基含量（鮮基）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛（MDA）含量、Ve、GSH和Vc含量的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，方法按產(chǎn)品說明書。Car含量的測(cè)定采用比色法[11]。煙葉中葉綠素（a、b和總量）的測(cè)定采用比色法[11]?？偡雍康臏y(cè)定采用Folin-酚法[11]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 活性氧含量

植物體內(nèi)活性氧由超氧陰離子自由基(O-2)、氫氧根負(fù)離子（OH-）、羥自由基(?OH)、過氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧(1O2)組成[12]。由圖 1、2可以看出，不同葉齡煙葉中O-2和?OH的含量沖積砂壤土和水稻黏土變化趨勢(shì)基本相同，沙性較高的河灘地砂壤土和粉砂土變化趨勢(shì)基本相同。第 30天沖積砂壤土和水稻黏土煙葉中 O-2的含量明顯低于河灘地砂壤土和粉砂土，而15～30 d煙葉中?OH含量則明顯高于河灘地砂壤土和粉砂土。4種土壤60 d葉齡煙葉中2種活性氧的含量均大幅度降低，此可能與煙葉逐漸衰老、呼吸減弱有關(guān)。

圖1 不同土壤中部葉超氧陰離子含量的變化Fig.1 The change of O-2 content in middle leaves from 4 soils

圖2 不同土壤中部葉羥自由基含量的變化Fig.2 The change of OH content in middle leaves from 4 soils

2.2 丙二醛含量

丙二醛（MDA）含量往往作為植物受到脅迫后體內(nèi)積累活性氧水平和細(xì)胞損傷的指標(biāo)[13-14]。由圖3可以看出，煙葉中MDA的含量均是低葉齡時(shí)較高，后逐漸降低，可能是幼齡葉呼吸旺盛對(duì)環(huán)境敏感，而老齡葉呼吸減弱對(duì)環(huán)境不敏感。粉砂土、河灘地砂壤土和沖積砂壤土3種土壤，中部葉中MDA的含量均高于水稻黏土，含量最高的是河灘地砂壤土。3種土壤葉齡15、30、45和60 d煙葉中MDA的平均含量分別比水稻黏土高 64.4%、76.3%、175.1%和237.1%。15～45 d葉齡河灘地砂壤土煙葉中MDA含量明顯高于沖積砂壤土和粉砂土，45～60 d葉齡粉砂土煙葉中MDA含量有一個(gè)躍升。水稻黏土煙葉中O-2和?OH含量較高而MDA含量則較低，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

圖3 不同土壤中部葉MDA含量變化Fig.3 The MDA content in middle leaves from 4 soils

2.3 總抗氧化能力

由圖4可以看出，中部葉總抗氧化能力粉砂土、河灘地砂壤土和沖積砂壤土，顯著高于水稻黏土，其中含量最高的是粉砂土。3種土壤葉齡15、30、45和60 d煙葉中總活性氧平均含量分別比水稻黏土高497.7%、790.4%、59.2%和42.7%。

圖4 不同土壤中部葉總抗氧化能力變化Fig.4 The antioxidant capacity in middle leaves from 4 soils

2.4 抗氧化酶活性

SOD主要清除 O-2，抗壞血酸過氧化物酶(APX)、POD、GR和CAT主要清除H2O2[15]。從圖5可以看出，中部葉中CAT、POD和GR活性水稻黏土較低，而SOD活性較高，可能與其煙葉中O-2含量較高有關(guān)（圖1）。葉齡30 d時(shí)河灘地砂壤土和粉砂土煙葉中的CAT和POD活力遠(yuǎn)高于水稻黏土和沖積砂壤土；而GR活力則是粉砂土和沖積砂壤土較高。

2.5 抗氧化物質(zhì)含量

由圖5可以看出，粉砂土、河灘地砂壤土和沖積砂壤土中，45和60 d葉齡煙葉總酚、類胡蘿卜素和Vc含量的變化趨勢(shì)均是高于水稻黏土，葉齡45和 60 d總酚含量平均比水稻黏土高 17.4%和42.5%，類胡蘿卜素含量平均高 73.0%和 40.4%，Vc含量平均高162.2%和252.4%。除沖積砂壤土外，粉砂土和河灘地砂壤土煙葉中 Ve含量明顯高于水稻黏土，葉齡45 d和60 d Ve平均含量比水稻黏土高33.6%和15.7%（圖5）。4種土壤煙葉中GSH的變化趨勢(shì)相同，數(shù)值相差不大（圖6）。

2.6 葉綠素含量

中部葉葉綠素a和b含量見圖7，第45～60 d煙葉中葉綠素a和b含量水稻黏土明顯高于其他3種土壤。粉砂土煙葉中葉綠素a和b的含量幾乎呈直線下降。葉綠素容易受到活性氧的氧化損傷，所以，水稻黏土植煙煙葉受到的氧化脅迫可能較輕，而粉砂土植煙煙葉受到的氧化脅迫可能較重。

圖5 不同土壤中部葉4種抗氧化酶活性的變化Fig.5 The change of antioxidant enzyme activity in middle leaves from 4 soils

3 討 論

生物受到不良環(huán)境條件的脅迫，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧積累，從而引起氧化應(yīng)激水平的增高，刺激體內(nèi)抗氧化酶活性和其他抗氧化物質(zhì)代償性增高，總抗氧化能力隨之增高，以對(duì)抗體內(nèi)增強(qiáng)的過氧化反應(yīng)，保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷[16-17]。水稻黏土植煙不同葉齡煙葉中部葉MDA含量和TAOC均較低，而葉綠素含量較高，可能是煙葉受到的因水分或營養(yǎng)脅迫造成的氧化脅迫較輕；河灘地砂壤土和沖積砂壤土不同葉齡煙葉中MDA含量和TAOC均較高，可能是煙葉受到的因水分或營養(yǎng)脅迫造成的氧化脅迫較重；而粉砂土植煙不同葉齡煙葉中TAOC較高，葉綠素、MDA含量較低，可能是由于粉砂土植煙烤煙在生長早期即受到較強(qiáng)的氧化脅迫，抗氧化能力在生長早期已經(jīng)達(dá)到高峰，MDA含量反而較低，且粉砂土植煙煙葉中葉綠素含量較低。因此，粉砂土植煙烤煙在生長過程中受到的氧化脅迫強(qiáng)于其他3種土壤。

TAOC由抗氧化酶活性和非酶抗氧化物質(zhì)組成，粉砂土、河灘地砂壤土和沖積砂壤土植煙中部葉TAOC高于水稻黏土的原因主要是由于CAT活性和類胡蘿卜素、總酚及Vc含量高有關(guān)。類胡蘿卜素是對(duì)烤煙香氣質(zhì)量有重要影響的潛香型萜烯類化合物，類胡蘿卜素的降解和熱裂解產(chǎn)物可生成近百種香氣化合物，這些化合物是構(gòu)成烤煙細(xì)膩、高雅、清新的主要香氣成分[18-19]。多酚是烤煙中重要的香氣前體物，煙葉中某些酚類物質(zhì)的含量與煙葉品質(zhì)及其芳香吸味呈正相關(guān)。煙葉中的多酚類化合物多為蕓香苷、綠原酸、咖啡酸、莨菪亭、兒茶酚等，這些多酚類化合物揮發(fā)性低，燃吸過程中直接進(jìn)入煙氣的很少，多分解為二元酚類和糠醛衍生物。多酚化合物在調(diào)制期間將發(fā)生一些重要反應(yīng)，使調(diào)制產(chǎn)物和香氣的復(fù)雜性增加，煙氣的平衡性和協(xié)調(diào)性得到改善。在煙葉燃吸期間（600 ℃以上），蕓香苷、綠原酸、咖啡酸、莨菪亭、兒茶酚等形成的熱裂解產(chǎn)物，許多對(duì)煙氣香味有直接影響，可賦予煙氣清甜香和烤香。另外，多酚類物質(zhì)在過氧化酶和多酚氧化酶的作用下，易氧化產(chǎn)生淡紅色至黑褐色的醌類物質(zhì)及其聚合物，導(dǎo)致煙葉顏色變?yōu)殚冱S或不同程度的棕褐色。加之多酚類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物還可與氨基酸、糖類和礦物質(zhì)等發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)，形成許多分子量大小不等、顏色各異的復(fù)合色素，并對(duì)香氣產(chǎn)生積極的影響[20-22]。所以，粉砂土、河灘地砂壤土和沖擊砂壤土植煙煙葉類胡蘿卜素和總酚高于水稻黏土可能是其焦甜香感優(yōu)于水稻黏土的主要原因。

圖6 不同土壤中部葉抗氧化物質(zhì)含量變化Fig.6 The change of ·antioxidant contents in middle leaves from 4 soils

圖7 不同土壤中部葉葉綠素a和b含量的變化Fig.7 The change of chlorophyll a and b in middle leaves from different soils

粉砂土植煙中后期由于土壤脫肥和干旱，煙葉中抗氧化酶活性和主要抗氧化物質(zhì)含量急劇下降，細(xì)胞受損嚴(yán)重，葉綠素含量迅速降低，影響了煙葉中各種物質(zhì)的合成，田間耐熟性差，對(duì)烤煙品質(zhì)不利，影響焦甜香風(fēng)格的形成。所以，適度氧化脅迫有利于烤煙焦甜香風(fēng)格的形成。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在皖南4種植煙土壤類型中，水稻黏土植煙烤煙在生長過程中受到的氧化脅迫較輕，河灘地砂壤土和沖積砂壤土植煙受到的氧化脅迫較重，粉砂土植煙烤煙受到的氧化脅迫強(qiáng)最重；粉砂土、河灘地砂壤土和沖積砂壤土植煙中部葉類胡蘿卜素、總酚含量高于水稻黏土，可能是其焦甜香風(fēng)格優(yōu)于水稻黏土的主要原因；適度氧化脅迫有利于烤煙焦甜香風(fēng)格的形成。

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