張麗麗， 敬應(yīng)春， 彭崇勝， 吳紅兵， 邱明豐

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地傣藥腎茶中的迷迭香酸

張麗麗， 敬應(yīng)春， 彭崇勝， 吳紅兵， 邱明豐*

(上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

目的 建立傣藥腎茶中迷迭香酸的測(cè)定方法，并測(cè)定不同產(chǎn)地腎茶中的迷迭香酸。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱 Agilent TC-C18(2)(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(25 ∶75);體積流量 1.0 mL/min;柱溫 25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，圖譜采集時(shí)間為20 min。結(jié)果 迷迭香酸在0.16～1.6 μg(r=1)范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，平均回收率為97.49%，RSD=1.15%(n=9)。結(jié)論 該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可行，可用于傣藥腎茶中迷迭香酸的測(cè)定及腎茶的質(zhì)量控制。

傣藥;腎茶;迷迭香酸;高效液相色譜法

傣藥腎茶(西雙版納傣醫(yī)稱(chēng)“芽糯妙”，意譯為“貓 須 草”)來(lái) 源 于Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu的全草，傣醫(yī)應(yīng)用歷史長(zhǎng)達(dá)2000多年，傣醫(yī)認(rèn)為其清香，苦，涼。入土、水塔，具有清熱解毒、利水通淋之功效，用于膀胱濕熱所致的尿急、尿熱、尿痛，非特異性下尿路感染見(jiàn)上述癥候者［1-2］。腎茶中主要含有迷迭香酸、熊果酸、黃酮類(lèi)及氨基酸等多種成分［3］。其中迷迭香酸藥理活性主要包括抗炎、抗氧化、免疫抑制等，是腎茶主要有效成分之一［4-5］，測(cè)定方法主要有分光光度法［6］和高效液相色譜法［7］。目前腎茶飲片［8］和腎茶袋泡茶均無(wú)迷迭香酸的測(cè)定項(xiàng)目。本實(shí)驗(yàn)建立了測(cè)定不同產(chǎn)地腎茶中迷迭香酸的高效液相色譜法，為科學(xué)控制腎茶質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，為腎茶制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agient 1200型液相色譜儀，G1322A JP7306-7557在線(xiàn)真空脫氣機(jī)，G1311A DE62968658四元泵，G1329A DE64770852自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A DE63070860柱溫箱，G1315D DE64259927 DAD檢測(cè)器，ChemStation B.03.01色譜工作站(安捷倫科技有限公司);KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AL204 Mettler Toledo電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

迷迭香酸對(duì)照品(批號(hào):100415，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度大于98%);20個(gè)腎茶樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李學(xué)蘭研究員鑒定為腎茶Orthosiphonari Status全草，樣品編號(hào)及來(lái)源見(jiàn)表1。乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18(2)(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.1% 磷酸(25 ∶75);體積流量:1.0 mL/min;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm，圖譜采集時(shí)間為20 min。

表1 樣品編號(hào)及來(lái)源Tab.1 Number and origins of the samples

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取迷迭香酸對(duì)照品約4 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中加50%甲醇溶解定容，得0.16 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取1～20號(hào)腎茶粉末(過(guò)4號(hào)篩)各約0.36 g，精密稱(chēng)定，置50 mL量瓶中，加50%甲醇超聲提取30 min，冷卻，定容，搖勻，有機(jī)相微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，備用。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別將迷迭香酸對(duì)照品及供試品溶液10 μL進(jìn)樣高效液相色譜儀，理論塔板數(shù)以迷迭香酸峰計(jì)算不低于20 000，迷迭香酸峰與周?chē)宸蛛x度好。對(duì)照品及供試品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5 線(xiàn)性范圍考察 分別精密吸取迷迭香酸對(duì)照品溶液 1、2、4、6、8、10 μL 進(jìn)樣，采集色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以對(duì)照品的量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行回歸處理，得回歸方程:Y=2 447X－9.474，r=1.000。迷迭香酸在 0.16 ～1.6 μg范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，相同色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量4 μL，結(jié)果顯示峰面積RSD為0.43%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取20號(hào)樣品制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h精密吸取進(jìn)樣，采集圖譜，測(cè)定迷迭香酸峰面積，其RSD為1.95%，表明樣品中迷迭香酸在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 迷迭香酸對(duì)照品(A)與腎茶供試液(B)色譜Fig.1 HPLC trace of rosmarinic acid(A)and Orthosiphonari Status(B)

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取20號(hào)樣品按2.3項(xiàng)下制備方法，分別制備6份供試液，同一方法采集圖譜，測(cè)定迷迭香酸峰面積，并計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其 RSD為0.36%。

2.9 回收率試驗(yàn) 取腎茶粉末(20號(hào))9份，每份約0.18 g，精密稱(chēng)定，分別置50 mL量瓶中，按樣品中成分含有量的80%、100%、120%，分別精密加入迷迭香酸對(duì)照品溶液(0.16 mg/mL)，再加50%甲醇超聲提取 30 min，冷卻，定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣10 μL，采集圖譜，根據(jù)迷迭香酸峰面積計(jì)算(mg)，并計(jì)算回收率(%)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 樣品測(cè)定 將收集的腎茶按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，同樣色譜條件下進(jìn)樣(n=3)，采集圖譜，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。不同產(chǎn)地腎茶中迷迭香酸比較見(jiàn)表4。

表2 迷迭香酸的回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Recovery of rosmarinic acid

表3 腎茶中迷迭香酸的測(cè)定結(jié)果Tab.3 Content of rosmarinic acid

4 討論

4.1 樣品處理方法的選擇 考察了甲醇、水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇等不同提取溶劑，結(jié)果表明50%甲醇提取樣品HPLC圖譜雜峰數(shù)目少、迷迭香酸峰面積大，提取效果最好，所以選擇50%甲醇作為提取溶劑。比較了超聲波振蕩提取(15、30、45 min)和水浴加熱回流提取(2 h)兩種提取方法，結(jié)果顯示超聲15 min所得圖譜峰數(shù)目比較少，其他方法所得HPLC圖譜中峰數(shù)目以及各峰峰面積沒(méi)有明顯差別，考慮到超聲波振蕩提取法簡(jiǎn)便易行，所以選擇超聲波振蕩提取(30 min)制備供試品溶液。

表4 不同產(chǎn)地腎茶中迷迭香酸比較Tab.4 Content of rosmarinic acid in Orthosiphonari Status from different habitats

4.2 色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)所用色譜條件是在大量摸索試驗(yàn)以及參考文獻(xiàn)［9-12］的基礎(chǔ)上不斷優(yōu)化篩選而確定的。曾以甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，以乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相得到圖譜分離效果最好，故選定乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相。

4.3 測(cè)定結(jié)果 不同產(chǎn)地腎茶中的迷迭香酸量相差較大，云南腎茶最高，浙江、福建和海南三省腎茶居次，老撾、廣東和廣西較低。從迷迭香酸具有抗炎、抗氧化、免疫抑制等藥理活性角度看，在發(fā)揮腎茶這些方面作用時(shí)宜選則云南腎茶較佳。

致謝:腎茶樣品采集與鑒定得到了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所、西雙版納傣族自治州傣醫(yī)醫(yī)院(民族醫(yī)藥研究所)及相關(guān)單位和友人的大力支持與幫助。

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Determination of rosmarinic acid inDaiMedicine-Orthosiphonari Status(Shencha)from different habitats by HPLC

ZHANG Li-li， JING Ying-chun， PENG Chong-sheng， WU Hong-bing， QIU Ming-feng*

(School of Pharmacy，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200240)

DaiMedicine;Orthosiphonari Status(Shencha);rosmarinic acid;HPLC

2011-11-16

云南省科技廳項(xiàng)目(2008IF018，2009BC014);上海市科委項(xiàng)目(08DZ1971303)

張麗麗(1985—)，女，碩士生，從事中藥新制劑研究，Tel:(021)34205051，E-mail:susan.lilizh1224@163.com

*通信作者:邱明豐(1970—)，男，副教授，從事中藥新制劑與新劑型研究。Tel:(021)34204052，E-mail:mfqiu@sjtu.edu.cn

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R284.1

A

1001-1528(2011)08-1378-04