朱日然， 李啟艷， 朱宗敏， 黃 超

(1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東濟南 250012;2.山東省藥品檢驗所，山東 濟南 250010;3.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355)

HPLC法測定附子與其炮制品中雙酯型生物堿

朱日然1， 李啟艷2， 朱宗敏1， 黃 超3

(1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東濟南 250012;2.山東省藥品檢驗所，山東 濟南 250010;3.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355)

目的 通過測定附子及熟附片(干片蒸制)、黑順片、熟附片(鮮片蒸制)、鹽附子、炮附片中次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿的量，揭示炮制減毒的科學內(nèi)涵。方法 樣品采用10%氨水浸潤，乙醚超聲提取的方法;色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.2%冰醋酸(濃氨水調(diào)節(jié) pH 為7.29)(28 ∶72);檢測波長235 nm;結果 與生附子相比，次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿在清水黑順片、鹽附子等炮制品中的量大大降低;結論 本實驗從化學的角度闡釋了附子炮制減毒的科學依據(jù)。

附子;炮制品;雙酯型生物堿;高效液相色譜法

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx子根的加工品，具有回陽救逆，補火助陽，逐風寒濕邪的功效。附子的化學成分主要為劇毒的二萜雙酯類生物堿，包括次烏頭堿(hypaeonitine)、烏頭堿(aconitine)、新烏頭堿(mesaconitine)、塔拉弟胺(tatatisameine)、川烏堿甲(Chuan-wu-base A)等成分。為了減其毒性，提高臨床療效，通常対附子進行炮制，其炮制品包括黑順片、鹽附子、炮附片等。本實驗采用高效液相法對附子與其炮制品中雙酯型生物堿的量進行測定，以考察附子中雙酯型生物堿在炮制過程中的變化及輔料的對其影響［1-4］。

1 儀器與試藥

SK 5200H型超聲波提取機(中國科導超聲儀器有限公司制造);R-205型旋轉蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司);HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);PHS-3C型pH值測定儀(上海康儀儀器有限公司);安捷倫1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫)。

烏頭堿(110720-200208)、新烏頭堿(110799-200404)、次烏頭堿(110798-200404)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。生附子購自山東省中藥飲片廠，熟附片(干片蒸制)、清水黑順片、熟附片(鮮片蒸制)、鹽附子、無膽炮附片均為山東省中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗室炮制。附子經(jīng)山東省中醫(yī)院張學順教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aeonitum carmichaeliDeb的子根加工品。

2 方法

2.1 色譜條件［5-7］Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.2% 冰醋酸(濃氨水調(diào)節(jié) pH為7.29)(28∶72)，體積流量1 mL/min;檢測波長235 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計算應不低于3 000。采用此色譜條件，供試品及對照品色譜分離度良好，見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 方法與結果

2.2.1 供試品溶液的制備 取生附子樣品粉末(過40目篩)2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10%氨水3 mL，浸潤，精密加入乙醚50 mL，超聲提取30 min，濾過，并用15 mL乙醚分3次沖洗藥渣，合并濾液，置50℃水浴揮干乙醚，用0.01%鹽酸-甲醇溶解并轉移至10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 線性關系的考察 分別精密稱取在60℃減壓干燥4 h的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品適量，加0.01%鹽酸-甲醇制成各含烏頭堿0.027 36 mg/mL、次烏頭堿0.128 3 mg/mL、新烏頭堿0.123 2 mg/mL的混合溶液，作為對照品溶液。

分別精密吸取上述對照品溶液各 1、2、4、8、16、20 μL，注入液相色譜儀，分別測定峰面積積分值。分別以烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品的進樣量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，得烏頭堿回歸方程y=867.53x－0.452 5，相關系數(shù)r=0.999 9，新烏頭堿回歸方程y=1 056x－10.898，相關系數(shù)r=0.999 8，次烏頭堿回歸方程y=856.84x－7.577，相關系數(shù)r=0.999 9。表明烏頭堿進樣量在0.027 36 ～0.547 2 μg 之間、新烏頭堿進樣量在 0.128 3 ～2.566 4 μg之間、次烏頭堿進樣量在0.123 2～2.464 μg之間，與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.2.3 精密度實驗 精密吸取上述對照品溶液8 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣5次，按上述測定方法進行測定，結果烏頭堿的RSD為0.65%、新烏頭堿的RSD為0.71%、次烏頭堿的RSD為0.38%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取上述供試品溶液10 μL，每隔2 h進樣一次，測定雙酯型生物堿的峰面積積分值，共考察8 h，以觀察樣品溶液在檢測過程中待測成分的穩(wěn)定性，結果烏頭堿峰面積的RSD為0.66%、新烏頭堿峰面積的RSD為0.42%、次烏頭堿峰面積的RSD為0.78%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能夠滿足測定需要。

2.2.5 重復性試驗 取陜西產(chǎn)生附子樣品粉末(過40目篩)2 g，共取5份，按上述測定方法進行測定，分別計算烏頭堿、新烏頭堿及次烏頭堿的量，結果烏頭堿的平均質(zhì)量分數(shù)(n=5)為0.171 8 mg/g，RSD為1.05%;新烏頭堿的平均質(zhì)量分數(shù)(n=5)為0.518 1 mg/g，RSD 為1.56%;次烏頭堿的平均質(zhì)量分數(shù)(n=5)為 0.212 6 mg/g，RSD 為 1.74%;表明測定方法的重復性良好。

2.2.6 回收率試驗 對照品貯備液的制備 分別精密稱取在60℃減壓干燥4 h的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品適量，置10 mL量瓶中，加0.01%鹽酸-甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得(烏頭堿濃度為 0.172 5 mg/mL，次烏頭堿濃度為0.507 5 mg/mL，新烏頭堿濃度為 0.211 7 mg/mL)。

取陜西產(chǎn)生附子樣品粉末(過40目篩)1 g，共取5份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，每份分別加入上述對照品貯備液各1 mL，按2.2.1項下方法制得供試品溶液。照上述測定方法進行測定，計算回收率，結果見表1～3。結果表明，本方法的回收率良好。

表1 烏頭堿加樣回收率試驗結果Tab.1 The recovry results of aconitine

表2 次烏頭堿加樣回收率試驗結果Tab.2 The recovry results of mesaconitine

表3 新烏頭堿加樣回收率試驗結果Tab.3 The recovry results of aconitine hypaconitine

3 樣品的測定

取待測樣品粉末(過40目篩)2 g，按2.2.1項下方法制得供試品溶液。進樣10 μL，測定結果見表4。

表4 9種附子及炮制品的測定結果(n=3)Tab.4 Determination of 9 kinds of Aconitum carmichaeli and its processed products

4 討論

4.1 最大吸收波長的考察 取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品溶液，在200～400 nm期間進行掃描，結果3種溶液均在235 nm處有吸收峰，故選用235 nm 作為檢測波長［8-9］。

4.2 提取方法的考察 根據(jù)附子的性質(zhì)，采用氨水浸潤，乙醚超聲法進行提取?？疾炝擞绊懱崛〉闹饕蛩匕ò彼昧俊⒁颐延昧?、超聲時間，并以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿總量為指標，采用L9(34)正交試驗優(yōu)選最佳提取工藝，即加10%氨水2 mL，浸潤，再精密加入乙醚 50 mL，超聲提取 30 min［10-12］。

4.3 由上述測定結果可知:四川江油產(chǎn)生附子的次烏頭堿、新烏頭堿量遠高于陜西產(chǎn)生附子，而烏頭堿量卻明顯低于陜西生附子。附子的幾種炮制品中，鹽附子的3種雙酯型生物堿基本檢測不到，黑順片、熟附片(鮮片蒸)、熟附片(干片蒸)僅能檢測到少量的次烏頭堿，而炮附片除次烏頭堿外仍能檢測到較高量的新烏頭堿，說明經(jīng)過炮制后，鹽附子的毒性已經(jīng)大大降低，黑順片、熟附片(鮮片蒸)、熟附片(干片蒸)中僅有微量的毒性成分，而炮附片中主要毒性成分的含量仍較高。附子皮中的雙酯型生物堿量較生附子有所降低但明顯高于炮制品。

4.4 本實驗從化學的角度闡釋了附子炮制減毒的科學依據(jù)。通過比較生附子及其炮制品中3種主要類型生物堿相對量的變化規(guī)律，結果表明附子炮制品中烏頭堿幾乎全部破壞，而新烏頭堿和次烏頭堿的量大大降低，從而達到減毒的目的。

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Analysis of diester diterpenoid alkaloids(DDAs)inAconitum carmichaeliand its processed products by HPLC

ZHU Ri-ran1， LI Qi-yan2， ZHU Zong-min1， HUANG Chao3

(1.Hospital Affiliated to Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250012，China;2.Shandong Provincial Institute for Drug Control，Jinan 250010，China;3.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Aconitum carmichaeli;processed product;diester diterpenoid alkaloids(DDAs);HPLC

R284.1

A

1001-1528(2011)08-1375-04

2011-01-12

朱日然(1979—)，本科，主要從事中藥材質(zhì)量及中藥制劑開發(fā)的工作。Tel:(0531)81216522，E-mail:zhuriran@sina.com