田鶴，王旭，李曉明，郭敏

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽 110032）

機(jī)體從胚胎到發(fā)育成熟不僅經(jīng)歷細(xì)胞增殖的過程，同時(shí)也伴隨著細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，在胚胎器官發(fā)育中起著重要作用［1］。在細(xì)胞凋亡過程中，多種基因家族及其產(chǎn)物起著關(guān)鍵性的作用。研究報(bào)道，水的轉(zhuǎn)運(yùn)在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮一定的作用，在集合管中水的轉(zhuǎn)運(yùn)主要是通過水通道蛋白 2（aquaporin-2，AQP-2）來完成的［2］。為了進(jìn)一步探討AQP-2與細(xì)胞凋亡及集合管發(fā)育的關(guān)系，本研究通過免疫組織化學(xué)、體視學(xué)、電鏡和TUNEL染色法觀察小鼠腎集合管發(fā)育過程中AQP-2的表達(dá)和細(xì)胞凋亡情況，探討兩者的關(guān)系及在腎集合管發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和光、電鏡標(biāo)本制備

昆明小鼠，按雌雄比例1∶1同窩飼養(yǎng)，采用檢查陰道栓脫落的方法確定雌鼠受孕時(shí)間，以觀察到陰道栓脫落的最早時(shí)間計(jì)為胚齡（embryonic，E）0 d。記錄受孕時(shí)間，然后將孕鼠分籠飼養(yǎng)，每日早8：00和晚5：00觀察生產(chǎn)情況，以觀察到仔鼠出生的最早時(shí)間計(jì)為生后日齡（neonatal，N）0 d，記錄出生日期。選取 E16、17、18 d 的胎鼠和 N1、3、7、14、21、40 d 的仔鼠，每組取5只鼠。將孕鼠用乙醚麻醉后剖腹取胎鼠，E16，E17，E18 d 的胎鼠剖腹取腎，N1，N3，N7，N14，N21，N40 d仔鼠處死后取腎。左腎入10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，厚5μm，用作免疫組化和TUNEL染色。右腎以2.5﹪戊二醛固定，仔鼠腎臟的髓質(zhì)、胚胎全腎進(jìn)行樹脂包埋，取樹脂包埋塊，LKB-V型超薄切片機(jī)先切半薄切片，經(jīng)光鏡觀察選擇后進(jìn)行超薄切片，厚度為50~70 nm。醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，1200EX（JEOL）透射電鏡觀察。

1.2 免疫組織化學(xué)方法檢測AQP-2（SABC法）

石蠟切片脫蠟后，經(jīng)微波修復(fù)10 min后滴加3%H2O2室溫孵育10 min，滴加山羊血清封閉液室溫孵育 5 min，加一抗（濃度 1∶100）37℃孵育 1 h，滴加生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育30 min，滴加SABC 37℃孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，光鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照?？贵w稀釋均用pH7.4的PBS。

1.3 檢測細(xì)胞凋亡（TUNEL法）

石蠟切片脫蠟后，滴加蛋白酶K（20 mg/L溶于三羥甲基氨基甲烷/鹽酸中）室溫孵育15 min，滴加TUNEL混合溶液（50μL/片），37℃孵育 60 min，滴加轉(zhuǎn)化劑 POD（50μL/片），37℃孵育 30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片，光鏡下觀察。用不含末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的液體代替TUNEL混合溶液作陰性對(duì)照。

1.4 體視學(xué)測量

用SABC法染色的切片每個(gè)動(dòng)物的腎隨機(jī)取5張，切片在油鏡下按“S”形選取視野，采用方格測試系統(tǒng)，交點(diǎn)計(jì)數(shù)法測算AQP-2在集合管管腔膜陽性表達(dá)的面密度值，公式為：Sv=2Ll=2 Ix/Lc（Lc=ΣPc·a），式中Ix為陽性表達(dá)的細(xì)胞膜與測試方格的交點(diǎn)數(shù)，Pc為落在參照系的測試點(diǎn)數(shù)，a為方格的兩點(diǎn)間距離，相當(dāng)于實(shí)際長度的0.1 mm。用TUNEL法染色的切片每個(gè)動(dòng)物的腎隨機(jī)取5張，切片在400倍光鏡下按“S”形選取視野，采用方格測試系統(tǒng)，至少計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分比。細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS16.0軟件完成，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL染色結(jié)果

細(xì)胞核中有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞。N1 d小鼠的集合管上皮中可見陽性細(xì)胞（圖1），N7 d時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)最多（圖2）。N14 d開始，陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。

圖1 N1 d小鼠腎集合管，可見少量凋亡細(xì)胞 TUNEL染色×1 000Fig.1 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N1 d TUNELstaining×1 000

圖2 N7 d小鼠腎集合管，可見大量凋亡細(xì)胞 TUNEL染色×1 000Fig.2 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N7 d TUNELstaining×1 000

2.2 電鏡觀察結(jié)果（圖3，4）

圖3 N7 d小鼠腎集合管中的凋亡細(xì)胞 電鏡×6 500Fig.3 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N7 d Electron microscope×6 500

圖4 N7 d小鼠腎集合管中的凋亡細(xì)胞 電鏡×10 000Fig.4 The apoptotic cells in collecting ducts of mice at N7 d Electron microscope×10 000

N1 d即可見到凋亡細(xì)胞，N7 d的集合管中凋亡細(xì)胞明顯，凋亡細(xì)胞的主要表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，核固縮，染色質(zhì)凝聚成球形、半月狀、月牙狀。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色顯示，E17 d小鼠腎中出現(xiàn)集合管，此時(shí)可見AQP-2微弱表達(dá)，表達(dá)部位為集合管的管腔膜和胞質(zhì)內(nèi)，呈棕褐色（圖5）。隨后，在E18 d以及N1，3，7 d的集合管管腔膜和胞質(zhì)內(nèi)均有陽性表達(dá)的AQP-2，表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（圖6）。N14 d至N40 d的集合管中均可見陽性表達(dá)的AQP-2，但是表達(dá)強(qiáng)度無明顯變化。

圖5 E17 d小鼠腎集合管，AQP-2弱表達(dá) 免疫組化×1 000Fig.5 The expression of AQP-2 in collecting ducts was faint at E17 d Immunohistochemistry staining×1 000

圖6 N7 d小鼠腎集合管，AQP-2強(qiáng)表達(dá) 免疫組化×650Fig.6 The expression of AQP-2 in collecting ducts was strong at N7 d Immunohistochemistry staining×650

2.4 體視學(xué)測量

對(duì)TUNEL染色陽性的細(xì)胞進(jìn)行凋亡指數(shù)測量，結(jié)果顯示N1 d，集合管中細(xì)胞凋亡指數(shù)為（32.46±3.69）%，到N7 d達(dá)到高峰，細(xì)胞凋亡指數(shù)為（45.36±4.35）%，以后隨著日齡增加凋亡細(xì)胞逐漸減少。面密度值測量結(jié)果顯示，AQP-2從E17 d的胎鼠開始表達(dá)，至N7 d其表達(dá)量達(dá)最高峰，N7 d至N40 d，AQP-2的面密度值與前一時(shí)間點(diǎn)測量值比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

表1 小鼠腎集合管不同發(fā)育階段細(xì)胞凋亡指數(shù)以及AQP-2在集合管表達(dá)的面密度值（x±s）Tab.1 The apoptosis index and surface area density of AQP-2 in the collecting ducts during development（x±s）

3 討論

細(xì)胞凋亡是機(jī)體為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的一種自主有序的生理性死亡［3］。在組織、器官的發(fā)育過程中，細(xì)胞凋亡具有控制細(xì)胞數(shù)量，消除多余、衰老、異常細(xì)胞的作用［4］。凋亡的形態(tài)學(xué)特征之一是水的流失和細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞體積的縮小會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)外的滲透梯度，使水通過單純擴(kuò)散和借助水通道蛋白（如AQP-2）流出細(xì)胞，繼之啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過程［5，6］。

TUNEL是目前比較常用的探討細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)手段，本研究結(jié)果顯示，在N1 d的小鼠腎集合管中可見TUNEL陽性細(xì)胞，N7 d陽性細(xì)胞染色最強(qiáng)，凋亡指數(shù)最高，N7 d至N40 d凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。這表明集合管在N1 d至N7 d是發(fā)育的主要階段，雖然細(xì)胞數(shù)量已夠，但是集合管需要通過細(xì)胞凋亡來不斷清除因增生而過剩的細(xì)胞，以利于管腔的形成及調(diào)控自身的發(fā)育速度。N7 d至N40 d，生長和成熟是集合管的主要特點(diǎn)，此期的集合管不再分支，進(jìn)入發(fā)育完善時(shí)期［7］。為了鑒別TUNEL陽性細(xì)胞是否由于細(xì)胞自身分裂形成，本研究應(yīng)用電鏡技術(shù)觀察了集合管中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，結(jié)果與TUNEL染色一致。本研究結(jié)果顯示AQP-2在E17 d時(shí)開始出現(xiàn)表達(dá)，部位是集合管主細(xì)胞的管腔膜和細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，至N7 d表達(dá)強(qiáng)度最強(qiáng)，隨后表達(dá)強(qiáng)度無明顯改變。對(duì)在主細(xì)胞管腔膜表達(dá)的AQP-2進(jìn)行的面密度值測量顯示AQP-2表達(dá)的面密度值在N7 d達(dá)到最大值，之后無明顯變化。這些結(jié)果提示在集合管發(fā)育過程中，細(xì)胞凋亡與AQP-2有一定的相關(guān)性。Ma等［8］發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)AQP-2促進(jìn)細(xì)胞體積的縮小和凋亡過程的啟動(dòng)。Jablonski等［9］也證實(shí)在細(xì)胞凋亡過程中，過度表達(dá)的AQP-2失去活性，喪失對(duì)水的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，使細(xì)胞內(nèi)的離子環(huán)境有利于激活caspase等內(nèi)切酶，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，證實(shí)了AQP-2與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，與前人的結(jié)果相一致［10，11］。本研究認(rèn)為N1 d至N7 d是集合管快速發(fā)育的時(shí)期，此期集合管的細(xì)胞數(shù)量已足夠其生長需要，為了適應(yīng)自身的形態(tài)變化及有利于管腔的形成，需要以凋亡的形式來清除過剩的細(xì)胞。AQP-2的表達(dá)與此過程一致，即N1 d表達(dá)較強(qiáng)，至N7d達(dá)到最高峰，因此，我們推測小鼠腎集合管N1 d至N7 d快速發(fā)育期的細(xì)胞凋亡是由AQP-2介導(dǎo)的，AQP-2影響集合管的發(fā)育過程，關(guān)于此過程的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

［1］Gumbiner BM.Cell adhesion：the molecular basis of tissue architectureand morphogenesis［J］.Cell，1996，84（3）：345-357.

［2］鞠曉靜，朱振龍，魏守禮.水通道蛋白對(duì)凋亡的影響［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（1）：118-120.

［3］Wyllie AH，Kerr JF，Currie AR.Cell death：thesignificanceof apoptosis［J］.Int Revcytol，1980，68（6）：251-306.

［4］Fierlbeck W，Liu A，Coyle R，et al.Endothelial cell apoptosis during glomerular capillary lumen formation in vivo［J］.Soc Nephrol，2003，14（5）：1349-1354.

［5］劉美菊，孫愛剛，郭敏.水通道蛋白-2、4在小鼠集合管發(fā)生發(fā)育中的表達(dá)［J］.解剖學(xué)報(bào)，2006，37（5）：588-591.

［6］Agre P，Sasaki S，Chrispeels MJ.Aquaporins：a family of water channel proteins［J］.Physiol，1993，265（2）：463-476.

［7］朱平，姜敘誠.人胚胎腎小體和腎小管的發(fā)育［J］.解剖學(xué)報(bào)，1995，26（4）：414.

［8］Ma T，Yang B，Verkman AS.Cloningof anovel water and ureapermeable aquaporin from mouse exprssed strongly in colon，placenta，liver，and heart［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997，240（2）：324-328.

［9］Jablonski EM，Hughes FM.The potential role of caveolin-1 in inhibition of aquaporinsduringthe AVD［J］.Biol Cell，2006，98（1）：33-42.

［10］Flamenco P，Galizia L，Rivarola V，et al.Roll of AQP2 during apoptosisin cortical collectingduct cells［J］.Biol Cell，2009，101（40）：237-250.

［11］Rivarola V，F(xiàn)lamenco P，Melamud L，et al.Adaptation to alkalosis ind-uces cell cycledelay and apoptosis in cortical collecting cells：roleof Aquaporin-2［J］.Cell Physicol，2010，224（20）：405-413.