武慧麗，趙永青，侯亞紅，王雪蓮

(1.武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科，天津 300162;2.武警海南總隊醫(yī)院，?？?570100)

缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning，IP)是Zhao ZQ等在研究缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)心肌的保護(hù)過程中發(fā)現(xiàn)并提出的，因此將其定義為在心肌長期缺血之后，再灌注開始時，經(jīng)歷的短暫、重復(fù)缺血再灌注，從而起到保護(hù)缺血心肌的現(xiàn)象[1]。IP作為缺氧耐受現(xiàn)象的一種，與缺血預(yù)適應(yīng)一樣可以明顯減輕腦I/R損傷，明顯縮小腦梗死的體積，減輕遲發(fā)性的神經(jīng)元的凋亡，明顯改善缺血后的神經(jīng)功能[2]。近年研究表明，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)腦I/R損傷的細(xì)胞凋亡過程[3]，而p38是該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵成員之一，故本研究擬觀察IP對大鼠腦I/R損傷后凋亡細(xì)胞數(shù)目、p38蛋白表達(dá)的影響，探討IP對腦I/R損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

p38單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG購自鼎國生物制品公司，Western blot檢測試劑盒，小鼠抗大鼠β-actin抗體、BCA試劑盒、原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)法細(xì)胞凋亡檢測試驗盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗動物及分組

雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量250～300g，由武警醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物隨機(jī)分為3組(n=10):假手術(shù)組(sham組)、腦缺血/再灌注組(I/R組)和缺血后適應(yīng)組(IP組)。

1.3 實驗方法

用Longa法[4]制作大鼠局灶性腦I/R模型:大鼠稱重，10%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉，暴露右頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，在頸外動脈距其始端約2 mm處做一小切口，將3-0號尼龍線一端烤成小球形經(jīng)切口處插入頸外動脈，再經(jīng)頸內(nèi)動脈至大腦中動脈始端，栓塞大腦中動脈，造成局灶性腦缺血，大鼠腦缺血90min后，拔出尼龍線，恢復(fù)腦組織供血。Sham組大鼠在尼龍線小球端插入至大腦中動脈始端后，立即拔出。IP組在缺血90min后再灌注開始時將尼龍線拔出20s，再將尼龍線放進(jìn)20s，按上述時間循環(huán)3次，再進(jìn)行再灌注。

1.4 神經(jīng)病學(xué)評分

手術(shù)后功能缺損按Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分:0分，無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀;1分，不能完全伸展左前肢;2分，向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分，行走時向左側(cè)傾倒;4分，不能自行行走，有意識障礙。累積1分以上即可判斷模型成功建立。動物蘇醒后，觀察缺血動物的神經(jīng)功能缺失癥狀。

1.5 腦組織取材

腦缺血/再灌注24h后，用10%水合氯醛(300mg/kg)對大鼠進(jìn)行麻醉。每組5只大鼠用4%多聚甲醛灌注固定、斷頭取腦及后固定。切取額、頂葉腦組織，恒冷箱切片機(jī)冠狀連續(xù)切片，片厚 10μm，用于凋亡細(xì)胞的檢測。其余大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取腦，于冰上分離缺血側(cè)頂葉皮層腦組織，用冰生理鹽水沖洗后，迅速置于液氮罐中低溫保存用于Western blot。

1.6 TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞

冰凍切片按試劑盒說明進(jìn)行操作。光鏡下，腦組織切片中細(xì)胞呈棕色者為陽性細(xì)胞。高倍鏡下隨機(jī)選取每張切片梗死周邊組織五個視野，分別計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計算凋亡細(xì)胞百分率，取平均值。凋亡細(xì)胞百分率=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 Western blot檢測腦組織p38蛋白表達(dá)

Western blot檢測采用常規(guī)方法進(jìn)行。等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，用新鮮配制的含3%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)封閉，然后加入 p38單克隆抗體(1∶1000)，4℃反應(yīng)過夜。將膜取出，用PBS洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育 2 h，最后用化學(xué)發(fā)光法，X-線片記錄結(jié)果。CHemiDOC XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行免疫印跡分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 缺血后適應(yīng)對神經(jīng)病學(xué)評分的影響

各I/R組大鼠術(shù)后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷癥狀，大多表現(xiàn)為不同程度的左側(cè)前肢屈曲、向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，行走時向左側(cè)傾倒。Sham組大鼠有3只出現(xiàn)左前肢輕度屈曲癥狀。IP組大鼠神經(jīng)功能缺陷癥狀比I/R組明顯減輕。各組評分相比較，差異有顯著性(P＜0.01，表1)。

2.2 缺血后適應(yīng)對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

Sham組偶見凋亡細(xì)胞，I/R組缺血區(qū)可見較多凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核著色深，主要見于梗死灶周圍，與Sham組比較有顯著差異(P＜0.01)。IP組凋亡細(xì)胞百分率明顯減少，胞核顏色明顯變淺，與I/R組比較差異顯著(P＜0.01，表1)。

Tab.1 Effect of ischemic postconditioning on neurological deficit score and apoptosis(，n=10)

Tab.1 Effect of ischemic postconditioning on neurological deficit score and apoptosis(，n=10)

I/R:Ischemia/reperfusion;IP:Ischemic postconditioning**P＜0.01 vs sham group;##P＜0.01 vs I/R group

Group Neurological deficit score Apoptotic percentage(%)Sham 0.4±0.21 4.56±0.41 I/R 2.5±0.56** 39.52±2.27**IP 1.3±0.28## 18.69±1.53##

2.3 缺血后適應(yīng)對大鼠腦組織p38蛋白表達(dá)的影響

內(nèi)參β-actin在各組表達(dá)較為一致。p38蛋白表達(dá)在Sham組呈較低水平，p38/β-actin的灰度比值約為 0.09±0.02;局灶性腦缺血/再灌注后，p38蛋白表達(dá)明顯升高，p38/β-actin的灰度比值約為0.95±0.17，與Sham組相比差異有顯著性(P＜0.01);在IP組，p38蛋白表達(dá)明顯降低，但仍高于Sham 組，p38/β-actin的灰度比值約為0.36±0.09，與 Sham 組及IR組相比，差異非常顯著(P＜0.01，圖1)。

Fig.1 Western blot for p38 in the brain

3 討論

缺血后適應(yīng)與缺血預(yù)適應(yīng)均為機(jī)體對缺血性損傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，它們可以減輕再灌注損傷的多種觸發(fā)因素如:氧化、促炎性細(xì)胞因子、中性粒細(xì)胞等，從而減少凋亡的發(fā)生，減輕缺血細(xì)胞的損傷，縮小梗死體積。p38是MAPK家族成員之一，它的激活介導(dǎo)了多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并參與細(xì)胞生長、分化和凋亡等多種功能的調(diào)節(jié)。關(guān)于p38在腦缺血預(yù)適應(yīng)中的作用，報道的結(jié)果并不一致。Nishimura等研究發(fā)現(xiàn)腦缺血預(yù)適應(yīng)可通過誘導(dǎo)p38的激活來提高海馬組織對缺血的耐受能力，而Lee[5]的研究結(jié)果卻顯示細(xì)胞凋亡的發(fā)生與p38激活有關(guān)。那么在腦I/R后實施的缺血后適應(yīng)對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及p38的變化尚未見報道。

本實驗觀察了Sham組，缺血/再灌注組和IP組神經(jīng)細(xì)胞凋亡的變化及p38蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示:大鼠腦缺血/再灌注后凋亡細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量和p38蛋白表達(dá)水平均顯著升高，而IP組凋亡細(xì)胞數(shù)量和p38蛋白表達(dá)水平均顯著低于缺血/再灌注組。提示缺血后適應(yīng)可能通過下調(diào)p38蛋白表達(dá)，部分阻斷MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，減輕腦缺血/再灌注損傷的程度，與Lee的研究結(jié)果一致。

由于后適應(yīng)干預(yù)的時間是發(fā)生在缺血事件發(fā)生以后，這就為治療缺血性腦血管病臨床應(yīng)用提供了可能性。缺血后適應(yīng)的干預(yù)過程簡單，對于腦梗死早期血管成形術(shù)或介入治療血管再通過程中，后適應(yīng)可能有助于減少再灌注損傷，從而提高再灌注治療的療效，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

[1]Zhao Z Q，Corvera J S，Halkos M E，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(2):H579-588.

[2]Xing B，Chen H，Zhang M，et al.Ischemic post-conditioning protects brain and reduces inflammation in a rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion[J].JNeurochem，2008，105(5):1737-1745.

[3]王瑞敏，張全光，武 鵬，等.p38/caspase-3介導(dǎo)的MEF2C信號通路參與大鼠腦缺血再灌注損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27(5):530-534.

[4]Danielisová V，Némethová M，Gottlieb M，et al.The changesin endogenous antioxidant enzyme activity after postconditioning[J].Cell Mol Neurobio，2006，26(7-8):1181-1191.

[5]Lee S R，Lo E H.Interactions betweenp38mitogen-activated protein kinase and caspase-3 in cerebral endothelial cell death after hypoxia-reoxygenation[J].Stroke，2003，34(11):2704-2709.