趙淑琴，王秀靜，張世忠，曹 陽(yáng)，陳慧穎，李從德

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

線粒體通透性轉(zhuǎn)換(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)孔是位于線粒體內(nèi)膜上的一種非特異孔道[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)它在細(xì)胞死亡和/或凋亡的啟動(dòng)或終止以及缺血/復(fù)灌損傷的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中都具有關(guān)鍵作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)在老年小鼠的肝臟和淋巴細(xì)胞，線粒體上PT孔較易于開(kāi)放的現(xiàn)象[3]，這一發(fā)現(xiàn)提示線粒體PT孔與衰老有聯(lián)系[4]。由于在心肌衰老退化過(guò)程中，往往伴隨心肌細(xì)胞的死亡和凋亡，因此有理由推測(cè)，線粒體PT孔可能在心肌的自然衰退中扮演重要的角色。基于此，本研究對(duì)不同月齡SD大鼠心功能自然衰退過(guò)程中線粒體PT孔開(kāi)放改變以及誘發(fā)其改變的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

SD大鼠(32只，購(gòu)自同濟(jì)醫(yī)學(xué)院)分為3、6、9、12月齡4組(n=8)，各組大鼠雌雄各半。

1.2 心功能檢測(cè)

將SD大鼠(雌雄各半)用水合氯醛(0.4 g/kg)麻醉，固定于鼠手術(shù)臺(tái)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大鼠體溫保持在37℃，每隔30min定量補(bǔ)充麻藥(0.016 g/kg，)以維持麻醉狀態(tài)。在頸部作正中切口，暴露氣管，作氣管插管并接呼吸機(jī)(潮氣量為2 ml，呼吸頻率為70counts/min)，然后分離大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈，將頸總動(dòng)脈插管一端與壓力傳感器相連，另一端緩慢插入頸總動(dòng)脈直至左心室，用Biopac16道生物信號(hào)記錄系統(tǒng)記錄左室收縮壓(left ventrucular systolic pressure，LVSP)、左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室壓上升/下降最大速率±dp/dtmax(the maximal rate of rise/fall of left ventricular pressure)。

1.3 線粒體形態(tài)學(xué)檢測(cè)

梯度離心法分離心肌細(xì)胞的線粒體，10%福爾馬林固定，切片電鏡觀察線粒體形態(tài)。

1.4 線粒體PT孔開(kāi)放檢測(cè)

以梯度離心法分離心肌細(xì)胞的線粒體，以200μmol/L Ca2+，誘發(fā)MPTP孔的開(kāi)放，采用線粒體基質(zhì)腫脹法檢測(cè)520nm處線粒體吸光度的減小速度和幅度，持續(xù)觀察線粒體TP孔開(kāi)放狀態(tài)變化10min。

1.5 線粒體Mn-SOD活性檢測(cè)

梯度離心法分離心肌細(xì)胞線粒體，各組心肌線粒體Mn-SOD活性用試劑盒(購(gòu)自南京建成)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間均數(shù)比較用ANOVA和 Newman-Keuls法分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能檢測(cè)

隨大鼠月齡增加，9月齡和12月齡大鼠心室功能開(kāi)始出現(xiàn)減退改變，同 3月齡大鼠相比，LVSP減小(P＜0.01)，LVEDP增高(P＜0.01)，+dp/dtmax和-dp/dtmax均明顯減小(P＜0.01，表 1)。

2.2 線粒體形態(tài)學(xué)檢測(cè)

電鏡形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示，本實(shí)驗(yàn)所用的心肌線粒體分離方法得到的心肌線粒體呈圓形，電子密度較高，外膜光滑完整，內(nèi)脊排列整齊，完整無(wú)斷裂，線粒體內(nèi)無(wú)基質(zhì)腫脹(圖1)。

2.3 各組線粒體PT孔開(kāi)放檢測(cè)結(jié)果

隨大鼠月齡增長(zhǎng)，心肌線粒體PT孔開(kāi)放程度(圖2 A)和開(kāi)放速率(圖2B)逐漸增加，6月齡大鼠心肌線粒體PT孔開(kāi)放速率增加與3月齡比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，9月齡和12月齡大鼠線粒體PT孔開(kāi)放速率增加尤為明顯，同3月齡大鼠相比具有顯著差異(P＜0.01)。

Tab.1 Cardiac function measurement of rats from different months(，n=8)

Tab.1 Cardiac function measurement of rats from different months(，n=8)

M:Month;LVSP:Left ventrucular systolic pressure;LVEDP:Left ventricular end-diastolic pressure;HR:Heart rate;+dp/dt max:The maximal rate of rise of left ventricular pressure;-dp/dt max:The maximal rate of fall of left ventricular pressure**P＜0.01 vs 3M group;##P＜0.01 vs 9M group

Month LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) HR(beat/min) +dp/dt max(mmHg/s) -dp/dt max(mmHg/s)3 126.81±10.92 -1.04±0.21 424.71±63.72 3063.52±307.51 -3319.13±401.946 143.34±11.62 -4.77±0.79** 413.86±27.53 3695.23±223.25** -3624.53±319.979 89.04±12.35** 5.53±1.26** 423.67±27.45 2040.24±385.55** -2100.52±136.73**12 85.03±3.07** 17.00±3.00## 375.71±63.02 1679.53±225.27** -1372.42±215.45##

Fig.1 Electrograph of mitochondria from rat heart(×50k)

Fig.2 Changes of mitochondrial PT pore opening with month in-creasing

2.4 各組線粒體Mn-SOD活性檢測(cè)結(jié)果

除6月齡大鼠外，隨大鼠月齡增長(zhǎng)，心肌線粒體Mn-SOD活性逐漸減小，其中9月齡和12月齡大鼠心肌線粒體Mn-SOD活性減小顯著，與3月齡和6月齡大鼠相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01，圖3)。

Fig.3 Activity of Mn-SOD from mitochondria in different months group

3 討論

在衰老機(jī)制的研究中，線粒體功能障礙與衰老的關(guān)系受到極大的關(guān)注，這方面的研究文獻(xiàn)積累已相當(dāng)豐富?？偟挠^點(diǎn)認(rèn)為，線粒體是細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，線粒體產(chǎn)生過(guò)多的ROS可造成線粒體DNA(mtDNA)的氧化應(yīng)激損傷和呼吸鏈功能障礙，呼吸鏈功能障礙又可使線粒體產(chǎn)生更多的ROS，這三者相互聯(lián)系在一起形成一個(gè)惡性循環(huán)，逐漸發(fā)展導(dǎo)致線粒體功能障礙并最終損害細(xì)胞的功能和活性[5]。這些研究結(jié)果表明，線粒體功能障礙確實(shí)與衰老有著密切的聯(lián)系。

MPTP孔是位于線粒體內(nèi)膜上的一種非特異孔道。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)它在細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡和/或凋亡的啟動(dòng)或終止以及缺血/復(fù)灌損傷的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中都具有關(guān)鍵作用。由于在心肌衰老退化過(guò)程中，往往伴隨心肌細(xì)胞的死亡和凋亡，因此有理由推測(cè)，線粒體PT孔在心肌的自然衰退中扮演重要的角色。

為驗(yàn)證這一推測(cè)，本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)3、6、9、12月齡大鼠心功能進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)線粒體PT孔開(kāi)放狀態(tài)進(jìn)行同期檢測(cè)，從而動(dòng)態(tài)觀察了在心功能自然衰退過(guò)程中PT孔開(kāi)放狀態(tài)改變。

我們的研究結(jié)果表明，線粒體PT孔開(kāi)放隨大鼠月齡增加而呈逐漸增大的趨勢(shì)，其中9月齡和12月齡大鼠PT孔開(kāi)放程度明顯增強(qiáng)。對(duì)不同月齡大鼠心功能的檢測(cè)表明，9月齡和12月齡大鼠心功能開(kāi)始明顯減退。據(jù)此，我們推測(cè)，心肌線粒體PT孔開(kāi)放改變是先于心功能減退發(fā)生而出現(xiàn)的一個(gè)生理現(xiàn)象，從心功能減退時(shí)心肌線粒體PT孔開(kāi)放程度明顯增加的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，心肌線粒體PT孔開(kāi)放增強(qiáng)有可能是誘發(fā)心功能減退的一個(gè)重要生理啟動(dòng)機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)到隨月齡增加，大鼠線粒體Mn-SOD活性總體呈下降趨勢(shì)，其中在9月齡和12月齡心功能減退大鼠的下降尤為明顯，因此推測(cè)線粒體抗氧化能力的減退可能是造成線粒體PT孔開(kāi)放改變的一個(gè)重要因素，但是尚需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。另外，線粒體PT孔開(kāi)放誘發(fā)心功能減退的確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

[1]Bernardi P，F(xiàn)orte M.The mitochondrial permeability transition pore[J].Novartis Found Symp，2007，287:157-164.

[2]Gomez L，Li B，Mewton N，et al.Inhibition ofmitochondrial permeability transition pore opening:translation to patients[J].Cardiovasc Res，2009，83(2):226-233.

[3]Rottenberg H，Wu S.Mitochondrial dysfunction in lymphocytes from old mice:enhanced activation of the permeability transition[J].Biochem Biophys Res Commun，1997，240(1):68-74.

[4]Crompton M.Mitochondria and aging:a role for the permeability transition[J].Aging Cell，2004，3(1):3-6.

[5]Hiona A，Leeuwenburgh C.The role of mitochondrial DNA mutations in aging and sarcopenia:implications for the mitochondrial vicious cycle theory of aging[J].Exp Gerontol，2008，43(1):24-33.