劉海平,鄭兆云,胡 揚(yáng)

(1.溫州醫(yī)學(xué)院體育科學(xué)學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系,浙江 溫州 325035;2.北京體育大學(xué),北京 100084)

人類在低氧環(huán)境下產(chǎn)生的適應(yīng)性生理性變化存在明顯個(gè)體差異性。Ge等研究報(bào)道[1],在模擬海拔2800m低氧暴露24h血清促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)濃度變化存在明顯的不同(-41%—400%)。Chapman等對(duì)39名長(zhǎng)跑選手進(jìn)行Hi-Lo(2500m-1250m)低氧訓(xùn)練研究發(fā)現(xiàn)[2],Hi-Lo訓(xùn)練后,最大攝氧量(VO2max)的變化從-3.2到18.7 ml/(min·kg)不等。目前,國(guó)外有學(xué)者認(rèn)為人類在低氧環(huán)境下所產(chǎn)生的生理機(jī)能適應(yīng)性變化及活動(dòng)能力的差異性主要與決定人類生物性狀的遺傳物質(zhì)——基因有關(guān)[3]。

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)是促進(jìn)紅細(xì)胞生成增多(erythrocytosis)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,它促進(jìn)紅細(xì)胞生成增多來提高機(jī)體攜氧、運(yùn)氧能力。轉(zhuǎn)錄、表達(dá)控制生成EPO的基因是最早發(fā)現(xiàn)的低氧反應(yīng)基因。

選取位于人類EPO基因全序列第3541 bp處,即在 EPO基因3‘端增強(qiáng)子上,一個(gè) T/G單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP),簡(jiǎn)稱SNP/T3541G。本文研究中國(guó)北方漢族人群SNP/T3541G的分布特征,這可能對(duì)于探索個(gè)體低氧適應(yīng)差異性遺傳學(xué)影響因素有著積極的理論意義。

1 材料與方法

1.1 受試對(duì)象

本研究選取北京市普通高校大學(xué)本科學(xué)生206名,男性118名,女性88名。受試者選取基本要求:漢族,祖籍為東北三省、北京、天津、內(nèi)蒙河套地區(qū)及山東等省,年齡在18～22歲之間,體檢合格。受試者基本情況見表1。

Tab.1 Basic conditions of 206 subjects()

Tab.1 Basic conditions of 206 subjects()

Gender n Age(yr) Height(cm) Weight(kg)Male 118 20.29±1.26 174.95±5.50 69.22±11.18 Female 88 19.96±1.38 163.03±5.10 56.97±7.67

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取靜脈血2 ml,2%EDTA抗凝,用promega公司全血總DNA提取專用試劑盒提取受試者DNA。EPO基因SNP/T3541G多態(tài)性依據(jù)NCBI提供的EPO基因3‘端增強(qiáng)子序,利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。由于原基因序列3541 bp處無限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn),故對(duì)原序列進(jìn)行引物修飾,在基因序列的3544 bp處將堿基C變?yōu)锳后進(jìn)行引物設(shè)計(jì),得到一對(duì)引物,上引物:5‘ACT CTT GGC TTT TCT GTT TTC TGG G 3‘;下引物 :5‘ TAC TGC GGT G AG GCC TTGAAT GTA G3‘,引物經(jīng)Blast比對(duì)具有很高的特異性,引物由上海生工生物工程有限公司合成。20μl反應(yīng)體系:包括10mmol/L Tris-HCl(PH 8.3),50mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,0.001%明膠 ,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 200μmol/L,上下引物各 0.5μmol/L,Taq酶 1U,模板 100ng。各種均為TAK ARA產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增在 Gene Amp 2700進(jìn)行(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)。每次取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物上樣,在2%瓊脂糖電泳,80V跑30min檢驗(yàn)擴(kuò)增效果。PCR擴(kuò)增方案:(1)預(yù)變性95℃,5 min;(2)32個(gè)循環(huán),變性94℃50s;退火56℃40s;延伸72℃60s;(3)72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物為226 bp片段。限制性內(nèi)切酶AccI在37°C,5 h消化此段擴(kuò)增產(chǎn)物,3%瓊脂糖電泳,120V電壓60min,EB(ethidium bromide)染色,凝膠成像系統(tǒng)紫外光成像(上海復(fù)日)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計(jì)包(SPSS software for Windows 11.5 package)完成。中國(guó)北方漢族人群的EPO基因SNP/T3541G多態(tài)性基因型頻率是否符合Hardy-weinberg遺傳平衡定、及比較不同種族人群間基因型、等位基因頻率差異性,采用卡方檢驗(yàn)(chi-test,χ2)和精確率檢驗(yàn)(Fisher exact probability test)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 EPO基因SNP/T3541G的PCR-RFLP分析結(jié)果

EPO基因 SNP/T3541G位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段為226 bp,此片段用限制性內(nèi)切酶AccI消化,經(jīng)37℃,5 h酶切后,產(chǎn)物消化為 3個(gè)長(zhǎng)度片段,即 226 bp,201 bp,25 bp。SNP/T3541G破壞了3541 bp處的酶切位點(diǎn),因此TT基因型酶切后,產(chǎn)生2片段即;201bp,25 bp,突變雜合TG基因型酶切后,產(chǎn)生3片段,226 bp,201 bp,25 bp,突變純合 GG基因型消化后產(chǎn)生1片段,即226 bp。由于25 bp片段較小,在電泳時(shí)跑出瓊脂糖膠,電泳圖片拍照僅見2條電泳條帶(圖1)。

Fig.1 Electrophoretic mobility shift analysis of EPO SNP/T3541G Marker:PUC19 up to down:501 bp,489 bp,404 bp,331 bp,242 bp,190bp,147 bp,110bp

2.2 中國(guó)北方漢族人群與其它種族人群EPO基因SNP/T3541G分布特征的比較

卡方檢驗(yàn)結(jié)果表明,中國(guó)北方漢族人群的SNP/T3541G基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(χ2(df=2)=0.05,P>0.05),SNP/T3541G的基因型和等位基因頻率處于平衡狀態(tài)中,中國(guó)北方漢族人群基因型和等位基因頻率分別為TT為59%、TG為36%、GG為5%,等位基因T為77%、G為23%(表 2,表 3)。

中國(guó)北方漢族人群在SNP/T3541G多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率與非裔美國(guó)人相比存在非常顯著性差異(P<0.01),與歐洲人種相比存在顯著性差異(P<0.05),TG雜合基因型頻率由高至低依次為非裔美國(guó)人(40%)、中國(guó)北方漢族人群(36%)和歐洲人(29%);同時(shí)發(fā)現(xiàn),在非裔美國(guó)人中突變純合子GG基因型頻率高達(dá)20%(表2)。

Tab.2 Distribution of genotype frequencies of SNP/T3541G in different ethnic population

Tab.3 Distribution of allele frequencies of SNP/T3541G in different ethnic population

中國(guó)北方漢族人群在SNP/T3541G多態(tài)位點(diǎn)的等位基因頻率與非裔美國(guó)人相比有明顯差異(P<0.05),與歐洲人相比無顯著差別。

3 討論

EPO基因是發(fā)現(xiàn)最早的低氧反應(yīng)基因,該基因定位于7q22,由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子組成,編碼區(qū)從182 bp-763 bp,其編碼表達(dá)產(chǎn)物 EPO通過與紅系祖細(xì)胞膜上 EPOR結(jié)合,促進(jìn)紅系祖細(xì)胞由早期紅系祖細(xì)胞(BFU-E)到晚期紅系祖細(xì)胞(CFU-E)的增殖分化,最終形成成熟的紅細(xì)胞釋放入血,加強(qiáng)體內(nèi)氧氣運(yùn)送,改善組織、器官氧水平。另外,在低氧環(huán)境下,EPO還能促進(jìn)紅細(xì)胞釋放進(jìn)入血液,最終減輕低氧對(duì)機(jī)體的損傷。同時(shí),低氧環(huán)境下造成腦部缺血缺氧時(shí),腦部EPO生成量成倍增加,對(duì)神經(jīng)元免受低氧損傷起保護(hù)作用,且提高其存活能力。因此,研究EPO基因序列上多態(tài)位點(diǎn)可能對(duì)于了解不同個(gè)體對(duì)于低氧適應(yīng)差異性有著積極意義。

本研究選取的SNP/T3541G多態(tài)位點(diǎn)定位于7q2.2的53396 bp,人類EPO基因全序列3541 bp處[4],即在人類EPO基因3‘-端低氧誘導(dǎo)增強(qiáng)子序列3323 bp和3579 bp之間。該多態(tài)位點(diǎn)是國(guó)內(nèi)學(xué)者劉舒等于2000年首次在高原地區(qū)的漢、藏民族人群中發(fā)現(xiàn)報(bào)道。隨后,該研究小組又觀察報(bào)道了在平原居民也存在這一多態(tài)位點(diǎn)[5],但限于觀察例數(shù)少,不具有群體代表,沒能反映出SNP/T3541G在漢、藏人群中的分布特征。本研究則通過觀察SNP/T3541G在206名中國(guó)北方漢族人群中的分布特征,發(fā)現(xiàn)該TT基因型、TG基因型、GG基因型的頻率分別為59%、36%、5%;T、G等位基因頻率分別為77%,23%。這是該多態(tài)位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族人群中分布特點(diǎn)的首次報(bào)道。對(duì)于中國(guó)北方漢族人群此多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率與非裔美國(guó)人和歐洲人種相比均存在明顯差異,中國(guó)北方漢族突變純合子 GG基因型頻率(5%)明顯低于非裔美國(guó)人(20%),而雜合子TG基因型頻率(36%)明顯高于歐洲人(29%);等位基因頻率比較研究發(fā)現(xiàn),中國(guó)北方漢族人群與非裔美國(guó)人存在顯著差異,即t等位基因頻率低于非裔美國(guó)人,但與歐洲人相比無明顯差異。

EPO基因受低氧誘導(dǎo)主要與其3‘端存在一個(gè)低氧誘導(dǎo)增強(qiáng)子有關(guān),該增強(qiáng)子的核苷酸序列從3324p-3579bp之間,功能上可以分成三個(gè)相互作用的部分,第一部分為(site 1)核苷酸4-11序列(CACGTGCT),是低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)和另外兩種結(jié)構(gòu)性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子ATF-1,cyclic-AMP-responsive element-binding protein-1(CREB-1)的結(jié)合位點(diǎn)[3],HIF-1通過與這一位點(diǎn)結(jié)合,誘導(dǎo)EPO基因3‘端增強(qiáng)子的功能,促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá);中間部分(site 2)在17 bp～22 bp之間,由三個(gè)CA核苷酸重復(fù)子組成,特異性結(jié)合于此部位的反式作用因子可能是一種結(jié)構(gòu)性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)尚不清楚,但這一部分區(qū)域發(fā)生直接影響到增強(qiáng)子的功能;第三部分(site 3)的核苷酸序列高度保守 ,在 DNA 反義鏈上該序 5’-AGGTCG ACAGGTCA-3’,由兩個(gè)順向重復(fù)子組成,該重復(fù)子是核內(nèi)激素受體超家族成員的結(jié)合位點(diǎn),其結(jié)合的特異性由重復(fù)子間寡核苷酸數(shù)目決定。在其基因序列3512 bp～3740bp片段作為順式調(diào)控元件有放多因子結(jié)合,如HIF-1,肝核因子(hepatie nuclear factor-4,HNF-4)等,調(diào)節(jié) EPO的表達(dá),對(duì) EPO轉(zhuǎn)錄起著重要作用。SNP/T3541G位于此片段間,可能與促進(jìn)紅細(xì)胞生成有關(guān),有報(bào)道,對(duì)低氧適應(yīng)良好的藏族人群雜合子TG基因型頻率達(dá)到53%,且攜帶TG基因型藏族人群與高原紅細(xì)胞增多癥有著微相關(guān)[4,5],這一研究結(jié)果由于樣本量較小,有待于進(jìn)一步研究。

由此可見,不同種族人群中EPO基因SNP/T3541G多態(tài)性分布存在差異性,這對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)低氧適應(yīng)個(gè)體差異性的分子生物學(xué)機(jī)理有著重要意義。

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