(河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部，保定071002)

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是由于出生前或出生時缺氧所造成的，患兒多留有腦癱、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。目前，對于新生兒缺氧缺血性腦損傷的有效治療方法一直是國內(nèi)新生兒科學(xué)的研究熱點。近年來，中藥對缺氧缺血性腦損傷的治療作用越來越多的引起人們的關(guān)注。中藥的活性成分可以多靶點地作用于腦缺血缺氧損傷后的環(huán)節(jié)。

燈盞花注射液(breviscapin injection，BI)具有抗氧化，清除自由基，擴(kuò)張微血管的作用。目前，臨床主要用于治療腦梗塞引起的腦缺血，及其后遺癥的治療。本研究通過建立新生鼠缺氧缺血腦損傷模型，觀察了燈盞花注射液干預(yù)新生大鼠HIBD后患側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度和組織學(xué)分級以及凋亡相關(guān)基因Bcl-2(B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，B cell lymphoma/leukemia-2)、Bax(Bcl-2 associated X protein)蛋白表達(dá)情況，探討燈盞花注射液對新生鼠腦損傷后Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響和神經(jīng)元保護(hù)作用，從而為臨床新生兒HIBD的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

120只清潔級新生7日齡SD大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體質(zhì)量12～18 g，雌雄不限。隨機(jī)分為6組(n=20):假手術(shù)組(Sham組):假手術(shù)組術(shù)中只暴露左側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎，術(shù)后也不進(jìn)行缺氧;模型組(HIBD組):模型組按照吳婉芳[1]等的方法造模。造成腦組織的缺血缺氧損傷;對照組(Control組):對照組在造模完成后，即刻開始腹腔注射無菌注射用水，劑量為0.05 ml/10g，每天1次;燈盞花治療組(BI-10mg、20mg、40mg):燈盞花治療組在造模完成后，即刻開始腹腔注射燈盞花注射液，分為 10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg三個亞劑量組，每天1次。

以上動物分別于造模后24h、3 d、7 d、14 d斷頭取材，硫堇染色后行腦組織病理學(xué)檢查。

另96只新生7日齡SD大鼠隨機(jī)分為4組(n=24):假手術(shù)組、模型組、10mg/kg燈盞花治療組、對照組，于造模后24h、3 d、7 d、14 d斷頭取材，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況，并計數(shù)各組各時間點免疫陽性細(xì)胞數(shù)目及積分光密度值。

1.2 藥品與儀器

燈盞花注射液為神威藥業(yè)生產(chǎn)，規(guī)格5 ml∶20mg。免疫組化試劑盒購自晶美生物工程有限公司生產(chǎn)。Bcl-2抗體，Santa公司(SC492);Bax抗體，Santa公司(SC526)。石蠟切片機(jī)，Leica公司;Olympus光學(xué)顯微鏡，日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會社;捷達(dá)JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司;二目顯微鏡攝像系統(tǒng)，北京麥克奧迪儀器儀表有限公司。

1.3 造模方法

參照吳婉芳[1]等的方法，將大鼠固定在手術(shù)板上。行頸部手術(shù)造成大鼠腦組織缺血:頸部正中切口，分離并雙線結(jié)扎左側(cè)頸總動脈。頸部術(shù)畢，恢復(fù)2 h。之后，將結(jié)扎后的新生鼠置于37℃恒溫水浴2500ml密閉玻璃容器中，以1.5～2.5 l/min的速度輸入體積濃度8%的氧氣和92%氮氣的混合氣體。測氧儀監(jiān)測艙內(nèi)氧濃度，使之維持在7.5%～8.5%之間，持續(xù)2～3 h。缺氧完成后取出新生大鼠并放回母鼠籠中繼續(xù)哺乳喂養(yǎng)。

1.4 染色方法

1.4.1 硫堇染色方法 在預(yù)定時間點將動物迅速斷頭取腦，冠狀切取視交叉后1 mm至4 mm腦組織，將所取標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h，梯度酒精脫水;二甲苯透明，石蠟包埋。將所取腦組織標(biāo)本常規(guī)腦組織切片(5μm 厚)，切片以二甲苯、梯度酒精(100%～70%)脫蠟至水，浸入0.25%硫堇溶液中47℃染色10min，80%～95%酒精脫色至適度，無水酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片。

參照Kato分級方法[2]，于光學(xué)顯微鏡下，根據(jù)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡(delayed neuronal death，DND)的程度，確定組織學(xué)分級(histological grade，HG)和神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)，對海馬CA1區(qū)組織學(xué)改變進(jìn)行評價。(1)HG:0級，無神經(jīng)元死亡;1級:散在神經(jīng)元死亡;2級:成片神經(jīng)元死亡;3級:幾乎全部的神經(jīng)元死亡。取左側(cè)平均等級作為統(tǒng)計值。(2)ND:計數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片左側(cè)海馬各計數(shù)3個區(qū)段取平均值作為統(tǒng)計值。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色方法 在預(yù)定時間點將動物迅速斷頭取腦，冠狀切取視交叉后1 mm至4 mm腦組織，將所取標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h，梯度酒精脫水;二甲苯透明，石蠟包埋。將所取腦組織標(biāo)本常規(guī)腦組織切片(5μm厚)，切片以二甲苯脫蠟及梯度酒精脫水，PBS洗 15 min，0.3%H2O2，甲醇液37℃下孵育15 min以去除內(nèi)源性過氧化酶，PBS洗 3次，每次 5 min，0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液修復(fù)抗原，置 95～98℃，20min;正常羊血清封閉，在37℃濕盒中溫育20min，吸去血清，加入Bcl-2或Bax蛋白多克隆抗體(1∶100稀釋)，4℃過夜;依次加入生物素化二抗及三抗，室溫下各孵育50min;DAB顯色;鏡下控制，流水沖洗終止，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每次實驗均設(shè)陰性對照，以PBS代替一抗，結(jié)果顯示陰性。

判斷標(biāo)準(zhǔn):陽性反應(yīng)胞漿內(nèi)呈棕黃色染色，陰性結(jié)果則為胞漿內(nèi)無棕黃色。計數(shù)400倍視野下海馬CA1區(qū)Bcl-2或Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析:組織學(xué)分級采用多樣本資料的秩和檢驗。細(xì)胞計數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花注射液對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度的影響

Sham組中，各時間點大鼠海馬CA1區(qū)未見明顯神經(jīng)細(xì)胞缺失。HIBD組、Control組各時間點與Sham組比較，神經(jīng)元密度明顯降低(P＜0.05)，組織學(xué)分級顯著增高(P＜0.05)。BI-10mg組，與對照組相應(yīng)時間點比較，神經(jīng)元密度顯著高于對照組(P＜0.05)，組織學(xué)分級明顯降低(P＜0.05)。20mg治療組中，7 d時與Control組相應(yīng)時間比較差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。40mg治療組中，各相應(yīng)時間點與Control組比較，未見明顯差別(表1，圖1、4)。

Tab.1 Quantitative presentation of the number of survival pyramidalneurons in the CA1 hippocampus(，n=5)

Tab.1 Quantitative presentation of the number of survival pyramidalneurons in the CA1 hippocampus(，n=5)

HIBD:Hypoxic-ischemic brain damage*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs HIBD group

Group 24h 3 d 7 d 14 d Sham 234.67±15.50 213.34±12.61 202.67±16.5 189.34±13.04 HIBD 196.60±6.30 136.67±23.00* 24.00±5.64* 21.67±6.51*Control 198.34±15.00 122.00±20.00* 34.00±7.50* 23.34±8.00*BI-10mg 210.67±17.42 176.00±16.29#△ 88.67±7.88#△ 75.34±16.87#△BI-20mg 200.34±30.12 154.67±26.31 43.67±22.76#△ 34.34±27.45 BI-40mg 199.34±36.66 139.34±18.78 39.33±7.89 26.67±12.98

2.2 燈盞花注射液對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元組織學(xué)分級的影響

Sham組中，組織學(xué)分級為0-1級;HIBD組、Control組各時間點與Sham組比較，組織學(xué)分級顯著升高，為2-3級;BI各劑量組與Control組比較，組織學(xué)分級降低，為1-2級。

Fig.1 Histological grade(HG)of the CA1 hippocampus with each group

2.3 燈盞花注射液對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

Sham組，大鼠海馬CA1區(qū)未見明顯的 Bcl-2、Bax陽性顆粒出現(xiàn)。HIBD組、Control組，與Sham組比較，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)于3 d時達(dá)到高峰。表現(xiàn)為陽性細(xì)胞數(shù)目最多，染色最深。BI-10mg治療組中，與Control組比較:Bcl-2蛋白，陽性細(xì)胞數(shù)目增多，蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，3 d增加最明顯，7 d、14 d時表達(dá)逐漸回落(P＜0.05);Bax蛋白，陽性細(xì)胞數(shù)目減少，蛋白表達(dá)減少，3 d最明顯(P＜0.05，表 2、3，圖 2、3、5、6 見下頁)。

Tab.2 Number of immunohistochemical staining positive cells in expression of Bcl-2 in the CA1 hippocampus(，n=6)

Tab.2 Number of immunohistochemical staining positive cells in expression of Bcl-2 in the CA1 hippocampus(，n=6)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs HIBD group

Group 24h 3 d 7 d 14 d Sham 1.00±1.00 2.00±1.00 1.33±0.58 1.15±0.67 HIBD 19.89±3.84* 54.89±1.92* 21.55±3.02* 6.22±2.17*Control 17.27±3.17* 56.26±1.11* 20.67±2.71* 8.34±1.65*BI-10mg 31.11±2.99 66.44±1.84#△ 35.66±3.76#△ 11.22±2.77#△

Tab.3 Number of immunohistochemical staining positive cells in expression of Bax in the CA1 hippocampus(，n=6)

Tab.3 Number of immunohistochemical staining positive cells in expression of Bax in the CA1 hippocampus(，n=6)

*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs HIBD group

Group 24h 3 d 7 d 14 d Sham 2.00±1.00 2.00±1.00 1.67±0.58 0.67±0.58 HIBD 25.56±1.26* 63.36±1.15* 34.44±5.55* 25.45±3.34*Control 27.68±1.97* 59.87±3.52* 36.62±4.83* 22.78±3.46*BI-10mg 17.78±3.42 37.12±2.28#△ 19.33±1.77#△ 12.11±1.35#△

Fig.2 Quantitative presentation of the immunohistochemistry with integral optical density(IOD)of the immunostaining on Bcl-2 expression in each group

Fig.3 Quantitative presentation of the immunohistochemistry with integral optical density(IOD)of the immunostaining on Bax expression in each group

Fig.4 Microphotographs of thionin staining showed breviscapin injection reduced delayed neuronal death(DND)of pyramidal neurons in the CA1 hippocampus(Thionin staining ×400，Scale bar=50μm)

3 討論

新生兒HIBD病情重，病死率高，存活兒多留有腦癱、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，其發(fā)病機(jī)制也十分復(fù)雜，是近年來新生兒科學(xué)的研究熱點。目前研究認(rèn)為，缺氧缺血腦損傷中，神經(jīng)元的死亡方式除了被動的壞死外，還有主動死亡過程:凋亡、遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。而腦缺血缺氧的嚴(yán)重程度、持續(xù)時間決定了腦組織是通過壞死還是凋亡途徑發(fā)生損傷。壞死發(fā)生于原發(fā)刺激的即刻，遲發(fā)性神經(jīng)元死亡發(fā)生于數(shù)小時后，僅涉及神經(jīng)元;凋亡出現(xiàn)于刺激后數(shù)小時至數(shù)天。根據(jù)各國學(xué)者對遲發(fā)性神經(jīng)元死亡進(jìn)行的一系列研究，提出其發(fā)生機(jī)制與興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用、自由基的損傷作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、能量代謝障礙、凋亡等方面有關(guān)。在HIBD過程中，凋亡神經(jīng)元是否發(fā)生繼發(fā)的能量衰竭決定了其是否會出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，而遲發(fā)性死亡的程度則決定了HIBD的遠(yuǎn)期預(yù)后[3]。

Fig.5 Microphotographs of immunohistochemical staining showed changes in expression of Bcl-2 in the CA1 hippocampus on3 d in each group(Immunohistochemical staining ×400，Scale bar=50μm)

Fig.6 Microphotographs of immunohistochemical staining showed changes in expression of Bax in the CA1 hippocampus on 3 d in each group(Immunohistochemical staining ×400，Scale bar=50μm)

Bcl-2家族與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切?，F(xiàn)已知與凋亡相關(guān)的基因基本上分為兩大類[4]:一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，如 Bax、Baxls、e-fos、e-jun、野生型p53、即早基因等;另一類是抑制凋亡的基因，如Bcl-2和Bcl-xl等。其中Bcl-2基因和Bax基因是目前較明確的一對在功能上相互對立的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，兩者同屬Bcl-2基因家族，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有表達(dá)。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，Bax則是與Bcl-2作用相反的促凋亡基因。原癌基因Bcl-2編碼26 kD的胞漿蛋白，在發(fā)育的細(xì)胞中表達(dá)，而成熟或走向凋亡的細(xì)胞中不表達(dá)。在細(xì)胞的凋亡過程中主要發(fā)揮抗凋亡作用。Bax作為Bcl-2家族的另一成員，其功能與Bcl-2相反，過度表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2的過度表達(dá)可以與Bax競爭結(jié)合，形成Bax-Bcl-2異二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡作用[5，6]。Bcl-2蛋白和Bax蛋白在細(xì)胞內(nèi)共存，但是存在形式有所差別。細(xì)胞中的Bcl-2蛋白常常以同源二聚體的形式存在，而Bax蛋白可自身形成同源二聚體，也可以和Bcl-2蛋白形成異源二聚體。當(dāng)Bcl-2蛋白以同源二聚體形式存在時，細(xì)胞趨向于存活;但如果Bax蛋白大量表達(dá)并與Bcl-2蛋白形成異源二聚體或自身形成同源二聚體時，細(xì)胞趨向于死亡[7，8]。

燈盞花注射液是從云南菊科植物燈盞細(xì)辛(即燈盞花)提取精制而成的?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，其有效成分為燈盞花總黃酮，包括a-羥基黃芩素和燈盞花素及其衍生物[9]，燈盞花總黃酮具有抗凝、改善微循環(huán)、改善脂質(zhì)代謝，清除自由基、減輕脂質(zhì)過氧化，同時具有鈣通道阻滯和蛋白激酶C(PKC)抑制等多方面藥理作用[10]。臨床上多用于高血壓、冠心病、腦血栓形成、腦血管意外所致癱瘓等疾病的輔助治療。

在本實驗過程中觀察到，Sham組，各時間點大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊，胞核飽滿，核仁清晰可見，位于中央。且未見有明顯Bcl-2、Bax陽性顆粒出現(xiàn)。HIBD組、Control組，與Sham組相應(yīng)時間點比較，出現(xiàn)較明顯的神經(jīng)元缺失、壞死，存活神經(jīng)元數(shù)目減少，組織學(xué)分級升高;Bcl-2、Bax蛋白自24h開始表達(dá)逐漸增加，并于3 d時達(dá)到高峰(與其余各時間點比較差別有顯著意義P＜0.05)。表現(xiàn)為陽性細(xì)胞數(shù)目最多，染色最深，7 d、14 d表達(dá)又有所降低，但仍較Sham組為多(P＜0.05)。燈盞花注射液10mg治療組中，Bcl-2蛋白，與Control組各相應(yīng)時間點比較，陽性細(xì)胞數(shù)目增多，蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，3 d增加最明顯，7 d、14 d時表達(dá)逐漸回落(P＜0.05);Bax蛋白，與Control組比較，陽性細(xì)胞數(shù)目減少，蛋白表達(dá)減少，3 d最明顯(P＜0.05)。神經(jīng)元密度顯著增高(P＜0.05)，組織學(xué)分級明顯降低(P＜0.05)。20mg治療組中，7 d時與Control組相應(yīng)時間比較差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。40mg治療組中，各相應(yīng)時間點與Control組比較，未見明顯差別。由以上結(jié)果我們可以得出結(jié)論:應(yīng)用燈盞花注射液對缺氧缺血腦損傷的新生鼠進(jìn)行干預(yù)后，可使其海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度增加，組織學(xué)分級降低，表明燈盞花注射液可以減輕海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。另一方面，應(yīng)用燈盞花后，可使抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，而使促凋亡蛋白Bax表達(dá)降低。說明燈盞花注射液可以減輕新生大鼠缺氧缺血腦損傷后神經(jīng)元的凋亡、遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的程度，從而對缺氧缺血腦損傷具有保護(hù)作用。

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