陳 燕，趙春玲，張春來，徐 倩

(瀘州醫(yī)學(xué)院生理教研室，四川 瀘州 646000)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是臨床上常見的疾病之一。研究發(fā)現(xiàn)[1，2]，無論是成人還是兒童，OSAS均可引起不同程度的認(rèn)知功能障礙。目前，OSAS引起認(rèn)知功能障礙的具體機(jī)制尚不明確，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為慢性間斷性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)對(duì)OSAS患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。研究表明，學(xué)習(xí)記憶功能與相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的含量及代謝改變有密切關(guān)系。慢性間斷性低氧發(fā)生過程中，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)會(huì)發(fā)生怎樣地進(jìn)行性變化，并且這種變化與學(xué)習(xí)記憶功能的進(jìn)行性變化是否一致，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過動(dòng)態(tài)觀察慢性間斷性低氧過程中大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及前額葉皮層、海馬膽堿能神經(jīng)元的動(dòng)態(tài)變化，以期探討慢性間斷性低氧對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的進(jìn)行性影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用SD雄性大鼠40只(瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供)，體重(250±20)g，隨機(jī)均分為 4組(n=10):對(duì)照組、CIH1周組、CIH3周組和CIH5周組。

1.2 動(dòng)物模型制作

參照薛全福等[3]制作的慢性間斷性低氧大鼠模型。將大鼠置于自制的有機(jī)玻璃艙內(nèi)，艙壁留有小縫隙與艙外相通，使艙內(nèi)氣壓與大氣壓平衡。向有機(jī)玻璃艙內(nèi)充入氮?dú)猓脭?shù)字測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)艙內(nèi)氧濃度。每次低氧開始時(shí)氧濃度從23%降至8%±1%，用時(shí)10min。低氧艙內(nèi)二氧化碳濃度始終＜3%，溫度保持(22±2)℃，每天低氧 8 h，連續(xù)低氧 1、3、5周。低氧期間大鼠攝食、飲水同常。

1.3 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試

對(duì)各組大鼠分別進(jìn)行連續(xù)7 d的Morris水迷宮(購自成都泰盟科技有限公司)測(cè)試，以評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能變化情況，分為以下3個(gè)實(shí)驗(yàn):(1)定位航行實(shí)驗(yàn)(水下隱匿平臺(tái)):實(shí)驗(yàn)平臺(tái)在水面下2 cm，放置在西北方向恒定位置。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)燈光亮度恒定。隨機(jī)按四個(gè)方向?qū)⒋笫蠓湃胨?，同時(shí)記錄大鼠游泳軌跡和時(shí)間。一旦大鼠到達(dá)平臺(tái)，時(shí)間和軌跡記錄就終止。讓大鼠在平臺(tái)上停留30s后，離開迷宮休息4 min，隨后又開始另一輪實(shí)驗(yàn)，直到4個(gè)象限都測(cè)試完畢。如果大鼠在120s內(nèi)不能找到平臺(tái)，則將其放到平臺(tái)上30s，在實(shí)驗(yàn)記錄上記下時(shí)間120s。該測(cè)試連續(xù)進(jìn)行5 d。(2)定位航行實(shí)驗(yàn)(水上可見平臺(tái)):實(shí)驗(yàn)平臺(tái)在水面上2 cm，記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，并讓其在平臺(tái)上停留30s。該測(cè)試連續(xù)進(jìn)行2 d。(3)空間搜索實(shí)驗(yàn)(無平臺(tái)):將平臺(tái)移出迷宮，大鼠從遠(yuǎn)離平臺(tái)方向的任一點(diǎn)放入迷宮，記錄其在60s中的游泳軌跡，計(jì)算其在目標(biāo)象限停留時(shí)間占整個(gè)游泳時(shí)間的百分率。本實(shí)驗(yàn)緊接在水上可見平臺(tái)實(shí)驗(yàn)第2天完成后進(jìn)行。

1.4 標(biāo)本制備

Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后，各組大鼠用乙醚麻醉后，迅速打開胸腔，暴露心臟。用生理鹽水快速灌注沖洗至右心耳流出液清亮，然后用4%多聚甲醛灌注固定。灌注完成后取出腦組織標(biāo)本，在視交叉后緣、大腦腳與橋腦交界處把腦冠狀切為三塊，置于4℃4%多聚甲醛中后固定8～12 h，石蠟包埋。

1.5 壞死神經(jīng)元計(jì)數(shù)

石蠟連續(xù)切片，厚度為4μm，間隔5張取1張，常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察，并在前額葉皮層取3個(gè)400倍視野進(jìn)行壞死神經(jīng)元計(jì)數(shù)并求平均值;對(duì)海馬CA1、CA3、齒狀回的全部壞死神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 ChAT免疫組化檢測(cè)

石蠟連續(xù)切片，厚度為4μm，間隔5張取1張，對(duì)前額葉皮層和海馬進(jìn)行抗ChAT多克隆抗體的免疫組織化學(xué)標(biāo)記。步驟為:石蠟切片脫蠟和水化后，PBS液沖洗5 min×3次;3%H2O2滴加在切片上，室溫靜置10min;PBS液沖洗5 min×3次;預(yù)熱的枸櫞酸鈉緩沖液水浴修復(fù)15 min;PBS液沖洗5 min×3次;滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min，甩去多余液;滴加兔抗ChAT多克隆抗體50μl(進(jìn)口分裝，購自上海朗頓生物科技有限公司)，置4℃冰箱過夜;37℃復(fù)溫45 min;PBS沖洗2 min×3次;滴加二步法非生物素檢測(cè)試劑盒中的試劑1(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37℃孵育20min;PBS沖洗2 min×3次;滴加二步法非生物素檢測(cè)試劑盒中的試劑2(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37℃孵育20min;PBS沖洗2 min×3次;DAB顯色、脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用PBS液代替。

1.7 圖像分析

ChAT免疫組化反應(yīng)產(chǎn)物定量分析采用光密度值OD表示，OD值的大小反應(yīng)產(chǎn)物的多少。利用顯微鏡照相系統(tǒng)拍攝前額葉皮層和海馬ChAT陽性表達(dá)情況，并利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)其進(jìn)行分析。各組每一只大鼠腦切片的前額葉皮層隨機(jī)選取3個(gè)400倍視野，分別測(cè)定其中陽性染色的OD值，求其平均值，作為該大鼠前額葉皮層的OD值。海馬則分別在齒狀回、CA1、CA2、CA3和CA4區(qū)隨機(jī)選取3個(gè)400倍視野，分別測(cè)定其中陽性染色的OD值，求其平均值，作為該大鼠海馬的OD值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各組前4個(gè)訓(xùn)練日逃避潛伏期隨時(shí)間變化逐漸縮短，第5個(gè)訓(xùn)練日開始成績(jī)趨于穩(wěn)定。RANOVA統(tǒng)計(jì)結(jié)果:組內(nèi)因素(訓(xùn)練天數(shù))F=121.029，P=0.000，而交互效應(yīng)(訓(xùn)練天數(shù)×組別)F=1.633，P=0.753，提示逃避潛伏期有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，但時(shí)間因素的作用不隨分組不同而不同。組間因素效應(yīng)的方差分析示組間因素(組別)F=3.218，P=0.000，提示分組因素起作用，各組逃避潛伏期總體而言不同。進(jìn)一步多重比較提示，與對(duì)照組比較，CIH5w 組第 1、2、3個(gè)訓(xùn)練日逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異具有顯著性(P＜0.05)，CIH1周組和CIH3周組逃避潛伏期延長(zhǎng)，但差異無顯著性(P＞0.05)。CIH各組逃避潛伏期隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸延長(zhǎng)趨勢(shì);組間比較，CIH1周組和CIH5周組第1、2、3個(gè)訓(xùn)練日逃避潛伏期差異具有顯著性(P＜0.05，圖1)。

Fig.1 Comparison of escape latency among four groups in place navigation

2.1.2 空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組比較，CIH1周組和CIH3周組大鼠在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比減少，但差異無顯著性(P＞0.05);CIH5周組大鼠停留時(shí)間明顯減少，差異具有顯著性(P＜0.05)。CIH各組在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減少，組間比較差異無顯著性(P＞0.05，圖 2)。

Fig.2 Percentage of time spent in the quadrantwhere the original platform of the control group and CIH groups in spatial probe

2.2 前額葉皮層、海馬壞死神經(jīng)元計(jì)數(shù)結(jié)果

HE染色后，在光鏡下觀察到對(duì)照組前額葉皮層和海馬神經(jīng)元大小、形態(tài)正常。CIH各組前額葉皮層和海馬出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元變性壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞明顯腫脹，胞漿出現(xiàn)空泡，細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞內(nèi)成分消失，胞體深染。與對(duì)照組比較，CIH各組前額葉皮層和海馬壞死神經(jīng)元數(shù)增多，并且隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，上述改變呈進(jìn)行性加重趨勢(shì)(表1)。

Tab.1 Quantity of necrosis neurons in prefrontal cortex and hippocampus(，n=10)

Tab.1 Quantity of necrosis neurons in prefrontal cortex and hippocampus(，n=10)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CIH1week group;△P＜0.05 vs CIH 3week group

Group Prefrontal cortex CA1 CA3 Dentate gyrus Control 2.00±1.89 1.00±0.74 2.00±1.56 3.10±2.56 CIH1w 10.50±3.57* 3.20±1.62 4.30±1.89 7.70±4.94 CIH3w 30.40±9.74*# 9.20±5.87*# 7.50±4.14*# 11.80±6.09*CIH5w 49.00±11.55*#△ 19.70±9.92*#△ 11.20±4.44*#△ 30.60±10.56*#△

2.3 前額葉皮層和海馬ChAT陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

ChAT免疫組化陽性表達(dá)定位于胞漿中，呈棕黃色顆粒，與背景對(duì)比度明顯，胞核不著色，經(jīng)蘇木素復(fù)染為藍(lán)色。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)未見著色。與對(duì)照組比較，CIH1周組前額葉皮層和海馬ChAT陽性表達(dá)減少，但差異無顯著性(P＞0.05);CIH3周組和CIH5周組前額葉皮層和海馬ChAT陽性表達(dá)明顯減少，差異具有顯著性(P＜0.05)。CIH各組前額葉皮層和海馬ChAT陽性表達(dá)隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)呈進(jìn)行性下降趨勢(shì);組間比較，CIH1周組與CIH3周組海馬ChAT陽性表達(dá)差異具有顯著性(P＜0.05)，CIH1周組與CIH5周組前額葉皮層和海馬ChAT陽性表達(dá)差異具有顯著性(P＜0.05，表2、圖3和圖4，見彩圖頁Ⅱ)。

3 討論

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是一種發(fā)病率較高的慢性睡眠呼吸疾患，在成年人中的發(fā)病率為2%～4%，是多種全身疾病的危險(xiǎn)因素[5]。認(rèn)知功能障礙是OSAS患者神經(jīng)系統(tǒng)受損的主要表現(xiàn)之一。大量臨床觀察顯示，慢性間斷性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)是引起患者認(rèn)知功能障礙的主要原因之一，但其確切機(jī)制尚不十分清楚。

Tab.2 OD of ChAT in prefrontal cortex and hippocampus(，n=5)

Tab.2 OD of ChAT in prefrontal cortex and hippocampus(，n=5)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CIH 1week group

Group OD of ChAT Prefrontal cortex Hippocampus Control 0.445±0.131 0.266±0.035 CIH1w 0.343±0.069 0.254±0.037 CIH3w 0.296±0.075* 0.191±0.038*#CIH5w 0.222±0.049*# 0.182±0.029*#

在機(jī)體所有器官中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)低氧最為敏感，低氧可引起學(xué)習(xí)、記憶、行為和情緒等高級(jí)功能障礙。本研究利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分別對(duì)CIH1周、CIH3周和CIH5周三組大鼠認(rèn)知功能變化進(jìn)行評(píng)價(jià)，以探討大鼠認(rèn)知行為隨CIH時(shí)間長(zhǎng)短的變化規(guī)律。Morris水迷宮是檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶(尤其是空間記憶)功能的較為可靠的方法。通過定位航行實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠的學(xué)習(xí)能力，逃避潛伏期越短，學(xué)習(xí)能力越強(qiáng);空間搜索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠記憶能力，平臺(tái)所在象限游泳時(shí)間占整個(gè)游泳時(shí)間百分比值越大，說明大鼠空間記憶能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組前4個(gè)訓(xùn)練日逃避潛伏期隨時(shí)間變化逐漸縮短，第5個(gè)訓(xùn)練日開始成績(jī)趨于穩(wěn)定，提示各組大鼠都具有一定的空間學(xué)習(xí)能力。隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)，CIH各組逃避潛伏期逐漸延長(zhǎng)，空間探索時(shí)原有平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比逐漸減少，與對(duì)照組比較，僅CIH5w組大鼠差異具有顯著性，提示隨著低氧的進(jìn)行，大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行性下降，但CIH要持續(xù)進(jìn)行一定時(shí)間后才會(huì)出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在著許多與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，其中海馬和前額葉皮層與空間認(rèn)知功能關(guān)系密切。海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要部位，海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的完整性是維持學(xué)習(xí)記憶的前提。前額葉皮層與海馬在解剖學(xué)上有密切的聯(lián)系，海馬接受前額葉皮層的傳入纖維，又通過傳出纖維投射至前額葉皮層，因此，前額葉皮層在認(rèn)知過程中也扮演了十分重要的角色。有研究表明，大腦皮層和海馬對(duì)低氧具有易感性，海馬CA1、CA3區(qū)對(duì)低氧尤為敏感，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度的低氧性損傷改變。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)前額葉皮層和海馬CA1、CA3、齒狀回壞死神經(jīng)元計(jì)數(shù)也發(fā)現(xiàn)，CIH各組前額葉皮層和海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化較大，與對(duì)照組比較，CIH各組前額葉皮層和海馬壞死神經(jīng)元數(shù)量增多，并且隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，壞死神經(jīng)元數(shù)量呈進(jìn)行性增多趨勢(shì)，CIH各時(shí)間組間也存在顯著差異，說明低氧不僅使前額葉皮層、海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)遭受破壞，神經(jīng)元變性壞死，而且這種病理性損傷隨著低氧的進(jìn)行呈慢性進(jìn)行性加重趨勢(shì)。CIH過程中，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行性下降可能與前額葉皮層、海馬病理性損傷慢性進(jìn)行性加重有關(guān)。

ChAT是與學(xué)習(xí)記憶最相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿合成過程中的限速酶，ChAT的生物活性和含量對(duì)乙酰膽堿促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)功能的正常發(fā)揮起著十分重要的作用。因此，ChAT在相關(guān)腦區(qū)含量的高低與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，與對(duì)照組比較，CIH各組大鼠前額葉皮層和海馬ChAT陽性表達(dá)減少，并且隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，CIH大鼠前額葉皮層和海馬ChAT陽性表達(dá)呈進(jìn)行性減少趨勢(shì)。這一結(jié)果說明CIH不僅使前額葉皮層、海馬ChAT含量減少，而且這種改變隨低氧的進(jìn)行呈慢性進(jìn)行性加重趨勢(shì)。CIH過程中，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行性下降可能與前額葉皮層、海馬ChAT含量慢性進(jìn)行性降低有關(guān)。國(guó)內(nèi)外在對(duì)各種腦損傷模型的研究中發(fā)現(xiàn)，腦損傷后可造成ChAT活性降低，并認(rèn)為這可能與腦損傷后的認(rèn)知缺失有關(guān)。如:Ricceri L[6]和田金洲[7]等就分別觀察到藥物性和缺血性腦損害時(shí)，大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，同時(shí)伴有海馬和/或大腦皮質(zhì)的ChAT活性降低，認(rèn)為ChAT活性降低可能是學(xué)習(xí)記憶障礙的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。然而引起研究者注意的是，與對(duì)照組比較CIH3w組大鼠并未出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能障礙，而其在前額葉皮層和海馬ChAT陽性表達(dá)減少卻與對(duì)照組有明顯差異，研究者認(rèn)為這可能表明在CIH導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙出現(xiàn)之前，膽堿能神經(jīng)元的損害就已經(jīng)發(fā)生了，這一結(jié)果提示單純的膽堿能神經(jīng)元受損似乎還不足以完全導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，認(rèn)知功能究竟是在哪些系統(tǒng)的參與下，通過何種機(jī)制來完成還有待于進(jìn)一步研究。

[1]Peng H，F(xiàn)erris R L，Matthews T，et al.Characterization of the human nicotinic acetylcholine receptor subunit alpha(alpha)9(CHRNA9)and alpha(alpha)10(CHRNA10)in lymphocytes[J].Life Sci，2004，76(3):263-280.

[2]Gotti C，Clementi F.Neuronal nicotinic receptors:from structure to pathol[J].Prog Neurobiol，2004，74(6):363-396.

[3]薛全福，謝劍鳴，胡長(zhǎng)貴，等.常壓缺氧性大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的建立[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，1989，12(6):350-351.

[4]邱 宏，金圍琴，金如鋒，等.水迷宮重復(fù)測(cè)量方差分析及其在SPSS中的實(shí)現(xiàn)[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2007，5(1):101-105.

[5]Li R C，Row BW，Kheirandish L，et al.Nitric oxide synthase and intermittenthypoxia-induced spatial learning deficits in the rat[J].Neurobiol Dis，2004，17(1):44-53.

[6]田金洲，尹軍祥，時(shí) 晶，等.大腦中動(dòng)脈梗塞模型大鼠海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和突觸素蛋白表達(dá)變化[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(20):54-56.

[7]Sallette J，Pons S，Devillers-Thiery A，et al.Nicotine upregulates its own receptors through enhanced intracellular maturation[J].Neuron，2005，46(4):595-607.