沈衛(wèi)星，袁 穎，姜正林，呂廣明，姚 健

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2.江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室，3.南通大學(xué)航海醫(yī)學(xué)研究所，江蘇 南通 226001)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。脊髓損傷因損壞了皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract，CST)，損傷平面以下仍存活的脊髓神經(jīng)細胞失去了大腦的神經(jīng)支配，不能進行隨意性的運動。脊髓損傷后隨意運動功能的恢復(fù)，很大程度上取決于皮質(zhì)脊髓束的軸索再生，及其與脊髓前角運動神經(jīng)元直接或間接的結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系的重建。

脊髓損傷后的皮質(zhì)脊髓束軸突再生與功能重建是世界性的醫(yī)學(xué)難題。臨床對脊髓損傷的治療，在減輕繼發(fā)性損傷、減少并發(fā)癥的基礎(chǔ)上，采用移植修復(fù)、分子干預(yù)、免疫治療、轉(zhuǎn)基因治療及組織工程修復(fù)等方法促進脊髓再生與修復(fù)。目前，這些治療方法存在諸多局限性。在重建脊髓與大腦的神經(jīng)通路方面，尤其是皮質(zhì)脊髓束的功能重建，雖然實驗研究取得了令人鼓舞的結(jié)果，然而尚沒有臨床成功應(yīng)用的報道。近年來，隨著微電極技術(shù)、計算機信息技術(shù)、材料科學(xué)的發(fā)展，采集脊髓損傷上游神經(jīng)傳導(dǎo)束或運動中樞在發(fā)出相應(yīng)運動指令時的電生理信號，經(jīng)植入的微電子芯片分析解碼，通過植入于脊髓相應(yīng)節(jié)段內(nèi)的微電極輸出至運動神經(jīng)元，從而實現(xiàn)機體功能的重建成為一個新的研究方向。若相關(guān)研究取得突破，將為脊髓損傷病人實現(xiàn)運動功能的恢復(fù)提供一個全新的康復(fù)治療方法，這無疑對截癱病人的康復(fù)具有重要的意義。

腦-機接口技術(shù)(brain-machine interface，BMI)通過實時采集大腦皮層各區(qū)神經(jīng)元作出相應(yīng)運動指令時的電生理信號，經(jīng)分析解碼實時控制機器臂等外接功能裝置，實現(xiàn)部分機體功能的重建[1]。在脊髓損傷處植入微電極芯片，采集分析大腦皮層發(fā)出的運動控制信號，整合處理后輸出到下行通路從而實現(xiàn)機體功能重建，將為脊髓損傷病人實現(xiàn)運動功能的恢復(fù)提供一個全新的治療方法。本研究探索皮質(zhì)脊髓束電生理信號的采集記錄方法，分析描述電信號的特征，從而為通過植入式微電極陣列進行信號采集的記錄方法建立一定的實驗基礎(chǔ)，為將來進一步研究脊髓損傷修復(fù)與功能重建提供有價值的神經(jīng)電生理基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康雄性SD大鼠，清潔級，體重240～260g。由南通大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 試劑及儀器

0.1 %Luxol fast blue(Sigma公司);神經(jīng)信號采集處理系統(tǒng)(cerebus system，美國聯(lián)合科技集團);微電極推進器(Pf5-1，日本光電);記錄電極(尖端直徑50-80μm，阻抗 550±40kΩ);神經(jīng)信號分析軟件(Off-line Sorter，Neuroexplorer);恒冷冰凍切片機(CM1900-Cryostat，德國Leica公司);正置顯微鏡(Leica DMR，德國Leica公司)。

1.3 動物手術(shù)

將大鼠稱重，經(jīng)腹腔注射復(fù)合麻醉劑(每100ml含水合氯醛4.25 g、硫酸鎂2.12 g、戊巴比妥鈉2.12 g，劑量0.2 ml/100g bw)，完全麻醉后固定頭頸及四肢，剪除術(shù)區(qū)鼠毛，0.5%碘伏液消毒，確定T7-8脊髓，以T8棘突為中心作背部正中切口，長約2 cm，依次切開皮膚、皮下組織，剝離椎旁肌肉，咬除T8棘突和全椎板至椎弓根部，部分咬除T7和T9椎板擴大椎管，顯露脊髓硬脊膜(長約l cm)。用顯微鑷沿正中線輕輕挑開硬脊膜，暴露脊髓，覆蓋浸有生理鹽水的紗布。

1.4 電極定位

參照Watson等的著作《The Rat Brain》和劉蘇等的相關(guān)研究[2]，確定待插入電極的位置:T8處電極深度680μm～800μm。將電極首先夾于液壓式微電極推進器的頭端，并將其固定于立體定位儀的移動臂。調(diào)節(jié)移動臂位置，使微電極垂直位于大鼠脊髓上方。微電極尖端位于脊髓后正中溝偏右180～200μm的上方。在距將要插入的電極約1 cm處的肌肉內(nèi)插入?yún)⒈入姌O，在大鼠右側(cè)大腿肌肉插入針灸針，用導(dǎo)線接入記錄系統(tǒng)的接地端子作動物接地。調(diào)節(jié)液壓式微電極推進器以10μm的推進間隔將記錄電極插入暴露的脊髓內(nèi)，插入深度為680μm～800μm。

1.5 皮質(zhì)脊髓束電信號的記錄

Cerebus神經(jīng)信號采集處理系統(tǒng)的各項參數(shù)設(shè)置:采集窗口時間長度1.6 ms，采集窗口信號幅度200～ 600μV，采樣頻率 30kHz，前置放大器放大倍數(shù)5000，高通濾波250Hz，低通濾波7.5 kHz，有效閾電位選擇為-60～-80μV。觀察記錄窗口的掃描波形，適當(dāng)調(diào)整記錄電極的深度，直至記錄窗口出現(xiàn)大于閾電位的放電波形，利用記錄系統(tǒng)軟件提供的色標(biāo)，以不同顏色區(qū)分不同記錄波形，將記錄窗口不同的疊加波形分別顯示于各子窗口。實時觀察信噪比(signal noise ratio，SNR)的大小，當(dāng)穩(wěn)定的SNR值大于2.5時記錄采集放電信號，以200s為一采集記錄時間長度，以系統(tǒng)規(guī)定的文件格式存儲以作進一步離線分析。每次實驗正常記錄40～60min。剪斷電極下游脊髓，觀察采集窗口波形變化，采集記錄200s。剪斷電極上游脊髓，觀察采集窗口波形變化，采集記錄200s。

1.6 電極位置的確認

記錄結(jié)束后，行灌注、固定、取材及后固定、脫水后，將大鼠脊髓第七胸段、第八胸段、第九胸段連續(xù)橫切面冰凍切片，進行Luxol fast blue染色，物鏡放大2.5倍，用Leica正置顯微鏡采圖，觀察記錄電極插入的節(jié)段、插入深度，確認記錄電極尖端位于皮質(zhì)脊髓束內(nèi)。

1.7 放電信號的分析處理

利用神經(jīng)信號分析軟件Offline Sorter、Neuroex-plorer對已存儲的信號文件進行波形特點的描述，包括波長、波幅、放電頻率、同一電極上記錄到的不同放電單元之間的同步性、兩根電極上記錄到的不同放電單元之間的同步性、放電信號的峰間期分析等。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)脊髓束自發(fā)放電的穩(wěn)定記錄

長時間穩(wěn)定記錄到皮質(zhì)脊髓束的自發(fā)放電，記錄時間大于60min。剪斷電極下游脊髓狀態(tài)下，記錄窗口顯示的信號波形與正常記錄狀態(tài)下無明顯區(qū)別。剪斷電極上游脊髓狀態(tài)下，記錄窗口顯示的只有基線信號，而放電信號波形已消失(圖1)

Fig.1 Recording of electrophysiological signals from CST

2.2 對采集信號的直觀描述

記錄到的放電波形為多個放電單位具有不同波幅的波形疊加，放電頻率高，呈連續(xù)陣發(fā)性，疊加的波形為先負后正一種形式，波寬為0.6～1.3 ms，波幅為-230～130μV。利用軟件作波形掃描圖，可見同一通道(同一根電極)采集到的較為清晰的電信號波形掃描圖(圖2)。

Fig.2 Scanogram of signals in one tunnel(10ms)

2.3 利用Neuro Explorer和Offline Sorter軟件對長時間穩(wěn)定記錄到的波形文件進行進一步分析的結(jié)果

利用Neuro Explorer神經(jīng)信號分析軟件對記錄的文件作放電頻率分析，時間窗為2 s(每2 s為一計數(shù)單位)作頻率直方圖，可見在200s的采集記錄過程中兩個通道各4個放電單位的放電頻率變化。各放電單位的放電頻率最高值為40times/s(陣發(fā)放狀態(tài))，其他放電單位均＜1 time/s，呈簇性發(fā)放(圖3)。

Fig.3 Frequency histogram of each unit in two tunnels(t=200s，bin=2 s)

利用Neuro Explorer神經(jīng)信號分析軟件對記錄的文件作放電信號峰間期(ISI)分析，時間窗設(shè)為1 ms?？梢娫?00s的采集記錄過程中兩個通道各4個放電單位的ISI變化。各放電單位的ISI最小值為3 ms，各放電單位最大放電頻率的ISI值≥20ms，即各放電單位的不應(yīng)期主要集中在20ms左右(圖4)，遠大于區(qū)分是否來自不同的放電單位的ISI≥3 ms的標(biāo)準[3]，說明采集到的放電波形來自各不相同的放電單位(神經(jīng)元)。

Fig.4 ISIH of each unit in two tunnels(bin=1 ms)

對不同通道和同一通道內(nèi)不同放電單位的自發(fā)放電，通過做脈沖掃描(Raster)，觀察放電的同步性(圖5、圖6)?？蓮膱D中看出，同時記錄的不同放電通道的自發(fā)放電存在一定的同步性，表明信號之間存在部分的功能相關(guān);同一通道內(nèi)不同放電單位的自發(fā)放電存在很明顯的同步性，表明同一記錄電極記錄到的自發(fā)放電信號來自大腦皮層同一功能區(qū)，定位于某一特定功能[4，5]。

Fig.5 Raster of each tunnel(arrows point at synch pulses)

Fig.6 Raster of each unit in two tunnels(arrows point at synch pulses)

3 討論

隨著研究方法的進步，人們對皮質(zhì)脊髓束的結(jié)構(gòu)和功能不斷有新的認識，相關(guān)研究至今仍是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。為了對SCI病人進行更好的治療，對有關(guān)皮質(zhì)脊髓束的臨床前期研究，如有關(guān)皮質(zhì)脊髓束傳導(dǎo)的神經(jīng)信號特點、應(yīng)用微電子技術(shù)重建脊髓功能等，這都需要對皮質(zhì)脊髓束進行形態(tài)學(xué)定位和功能定位，需要建立一套能長期穩(wěn)定地記錄采集皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)電信號并對其特性加以分析的方法。本實驗采用Cerebus神經(jīng)信號采集處理系統(tǒng)，利用記錄電極可在大鼠的皮質(zhì)脊髓束內(nèi)較長時間記錄到百萬數(shù)量級較為穩(wěn)定的微伏級神經(jīng)電信號，實驗結(jié)果理想。利用神經(jīng)信號分析軟件Offline Sorter和Neuroexplorer對電信號進行了分析，取得了較直觀的實驗結(jié)果。

正常記錄和剪斷電極下游脊髓狀態(tài)下記錄的波形、放電頻率無明顯差異，而剪斷電極上游脊髓狀態(tài)下記錄不到放電信號，結(jié)合電極的定位，提示實驗所采集記錄到的放電信號來自皮質(zhì)脊髓束。信噪比(SNR)是衡量記錄神經(jīng)電信號實驗效果的重要指標(biāo)，神經(jīng)電信號幅度有大有小，而系統(tǒng)干擾信號控制得越小，SNR值也就越大，表明記錄到的神經(jīng)電信號越純凈。本研究在多次實驗中均取得了很高的SNR值(2.88～11.75)，實驗平臺是成功有效的，實驗所采集記錄的神經(jīng)電信號數(shù)據(jù)是可信的。

波形掃描圖直觀再現(xiàn)在整個記錄時段同一通道(記錄電極)上所有的信號波形，通過拉開時間坐標(biāo)，可以清楚地觀察到一個個神經(jīng)信號波形的波長和波幅。本研究所采集記錄的神經(jīng)信號波形的波長均＞600μs，遠大于錐體細胞放電信號波長 ＞270μs的判斷標(biāo)準[6]，表明所采集記錄的神經(jīng)電信號可能是由錐體細胞發(fā)放的。脈沖掃描圖不包含信號波形信息，它體現(xiàn)在整個記錄時段同一通道(記錄電極)上神經(jīng)信號發(fā)放密度(節(jié)律)，也可將在同一通道記錄的多個單元信號分離為多個不同放電單位的脈沖掃描圖，分別體現(xiàn)各放電單位的神經(jīng)信號發(fā)放密度(節(jié)律)。

頻率直方圖描述通道各放電單位在整個記錄時段的放電頻率變化。本實驗觀察到放電單位的放電頻率最高值為40times/s，呈爆發(fā)性發(fā)放，多數(shù)放電單位的放電頻率＜1 time/s，呈簇性發(fā)放。

放電信號峰間期(ISI)分析通過作ISI直方圖(ISIH)來進行。ISI描述神經(jīng)信號相鄰波峰之間的間隔時間，反映了神經(jīng)信號發(fā)放的頻率穩(wěn)定性即信號發(fā)放的規(guī)律性。ISI相對集中，表明神經(jīng)信號的發(fā)放較有規(guī)律，ISI分布分散，表明神經(jīng)信號的發(fā)放呈無規(guī)律性。ISIH描述通道各放電單位在整個記錄時段的ISI。ISI的數(shù)值可作為判斷同一通道多組分信號分離為多個不同放電單位電信號的準確性[7]。本研究所作的ISI分析，各放電單位的ISI最小值為3 ms，最大值≥20ms，即各放電單位的不應(yīng)期主要集中在20ms左右。遠大于區(qū)分是否來自不同的放電單位的ISI≥3 ms的標(biāo)準，表明采集到的放電波形確實來自不同的放電單位(神經(jīng)元)[8]。

對不同放電通道和同一通道內(nèi)不同放電單位的自發(fā)放電的同步性分析，通過作脈沖掃描(Raster)圖進行。本研究從Raster圖中看出，同時記錄的不同放電通道的自發(fā)放電存在一定的同步性，表明信號之間存在部分的功能相關(guān);同一通道內(nèi)不同放電單位的自發(fā)放電存在很明顯的同步性，表明同一記錄電極記錄到的自發(fā)放電信號來自大腦皮層同一功能區(qū)，定位于某一特定功能，而且各放電單位存在一定的協(xié)同性[9]。

本研究進行的皮質(zhì)脊髓束電生理信號的采集記錄，分析描述電信號的特征，為通過植入式微電極陣列采集記錄電信號的方法建立了一定的實驗基礎(chǔ)，為將來進一步研究脊髓損傷修復(fù)與功能重建提供了有價值的神經(jīng)電生理基礎(chǔ)資料。

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