沈建良,黃友章,尹文杰,岑 堅(jiān),鄭培浩,宮立眾,劉 毅

(海軍總醫(yī)院血液科,北京 100048)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用已證實(shí),體內(nèi)應(yīng)用促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)可致骨髓纖維化或骨硬化[1-4]。TPO致骨髓纖維化的機(jī)制,目前仍未完全闡明。許多細(xì)胞因子,包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子、嗜堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)等參與TPO誘導(dǎo)的骨髓纖維化和骨硬化,現(xiàn)認(rèn)為TGF-β1發(fā)揮著樞木丑作用[5]。TGF-β1是一種多效性的細(xì)胞因子,既能刺激基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì),又能促進(jìn)抑制基質(zhì)降解的蛋白酶產(chǎn)生。TGF-β1由多種細(xì)胞系分泌產(chǎn)生,但主要由單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和巨核細(xì)胞-血小板系統(tǒng)分泌產(chǎn)生。研究表明,單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在TPO誘導(dǎo)的骨髓纖維化中不起關(guān)鍵作用[3],而一些證據(jù)支持巨核細(xì)胞-血小板系統(tǒng)在骨髓纖維化發(fā)生中的關(guān)鍵作用[6-7]?，F(xiàn)認(rèn)為,TPO是通過(guò)與骨髓巨核細(xì)胞的TPO受體結(jié)合,刺激巨核細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1、IL-1和基質(zhì)細(xì)胞活化蛋白等因子,作用于基質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)纖維化和骨硬化的形成。但是,巨核細(xì)胞的存在對(duì)于TPO所致的骨髓纖維化形成是否必需,即無(wú)巨核細(xì)胞存在時(shí)TPO能否直接刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞纖維形成,這一問(wèn)題尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。明確上述問(wèn)題,對(duì)于進(jìn)一步闡明TPO致骨髓纖維化的機(jī)制,尋找骨髓纖維化新的治療靶點(diǎn),具有重大意義。為此,作者在體外培養(yǎng)條件下,觀察了TPO對(duì)基質(zhì)細(xì)胞增殖,細(xì)胞外基質(zhì)形成以及膠原合成和表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源和分組培養(yǎng)

采集健康無(wú)血液病患者骨髓細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)標(biāo)本共10例),制備骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)懸液。用改良Dexter培養(yǎng)法[8]進(jìn)行培養(yǎng),即 IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco Medium,美國(guó)G ibco)內(nèi)含20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,美國(guó)Stemcell)下稱基礎(chǔ)培養(yǎng)液、3×108/L BMMNC。培養(yǎng)形式分三種,一種是25 cm2培養(yǎng)瓶,每瓶5ml;另一種是24孔培養(yǎng)板,每孔1 ml;第三種是24孔玻片培養(yǎng)板(實(shí)驗(yàn)前先在培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入12 mm×0.14 mm圓形玻片),每孔1 ml。置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(RMI3000S-7-VBA,美國(guó))中培養(yǎng),2 d后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)沖洗,去除非貼壁細(xì)胞。再次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液后,進(jìn)行如下分組實(shí)驗(yàn):對(duì)照組(C組):僅加基礎(chǔ)培養(yǎng)液;實(shí)驗(yàn)1組(T1組):基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)加入2μg/L重組人促血小板生成素注射液(recombinant human thrombopoietin,rhTPO,中國(guó)沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn));實(shí)驗(yàn)2組(T2組):基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入20μg/L rhTPO;實(shí)驗(yàn)3組(T3組):基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入200μg/L rhTPO;實(shí)驗(yàn)4組(T4組):基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)加入2000μg/L rhTPO。

培養(yǎng)過(guò)程中,每3 d換液1次。細(xì)胞匯合達(dá)80%～90%時(shí)(即培養(yǎng)的 14 d、21 d、28 d、35 d),用胰蛋白酶(美國(guó) R&D)-乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA,中國(guó)汕頭化學(xué)試劑廠),(0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA)消化細(xì)胞。各組所有細(xì)胞分瓶重新懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi),按上述分組培養(yǎng)體系繼續(xù)傳代培養(yǎng)。最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間為42 d(第4代)。Ⅲ型前膠原蛋白檢測(cè)組第28天時(shí)終止培養(yǎng)(第2代細(xì)胞)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 相對(duì)增殖指數(shù)檢測(cè)

按上述方法培養(yǎng)的5組細(xì)胞,在第14天時(shí)行四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT,美國(guó)Fluka)檢測(cè),以觀察不同TPO濃度對(duì)細(xì)胞相對(duì)增殖指數(shù)(relative proliferation index,RPI)的影響。

將C組和T3組培養(yǎng)14 d,21 d,28 d,35 d和42 d的細(xì)胞,常規(guī)胰酶-EDTA消化。取含細(xì)胞濃度5×107/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)液200μl,接種于96孔培養(yǎng)板中,37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)3 d后,行MTT試驗(yàn),以觀察同一TPO濃度作用不同時(shí)間對(duì)RPI的影響。

MTT試驗(yàn):每孔加入MTT(0.5 g/L)溶液20μl,孵育4h,400×g離心5 min,棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔中加入150μl二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,美國(guó)Baker),振蕩 10min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BHL21Elx800,美國(guó))于570nm處測(cè)定各孔光密度值(optical density,OD)。

RPI=(實(shí)驗(yàn)組OD-對(duì)照組OD)/對(duì)照組OD

1.3 纖維連接素、層粘素和Ⅳ型膠原檢測(cè)

在培養(yǎng)的42 d內(nèi),每培養(yǎng)7 d,取C組和 T3組24孔培養(yǎng)板內(nèi)玻片上細(xì)胞,用免疫組化試劑盒(中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)纖維連接素、層粘素和Ⅳ型膠原。按親和-生物素復(fù)合物(avidin-biotin complex,ABC)免疫組化技術(shù)操作,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,酒精脫水,二甲苯透明封片觀察。以 PBS代替一抗,設(shè)陰性對(duì)照。陰性反應(yīng)時(shí),細(xì)胞標(biāo)本呈現(xiàn)淺褐色(-);陽(yáng)性反應(yīng)時(shí),細(xì)胞標(biāo)本呈現(xiàn)褐色(+)或深褐色(++)。

1.4 Ⅲ型前膠原蛋白檢測(cè)[9]

取對(duì)照組、T1組和 T3組培養(yǎng)第28天的細(xì)胞(第2代細(xì)胞),調(diào)整細(xì)胞懸液濃度1.0×104/ml,接種1滴于特殊進(jìn)口培養(yǎng)皿中央孔中,每組3皿。待細(xì)胞貼壁后,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液,孵箱培養(yǎng)24h。PBS清洗,70%冰乙醇固定,置4℃冷育30min。PBS清洗,各加入50μl 10%FBS封閉非特異性抗原,室溫20min。加入1∶400鼠抗人Ⅲ型膠原單克隆抗體(英國(guó)Abcam)10μl,置 4℃濕盒,冷育 24h。PBS清洗,加入1∶8異硫氰酸熒光素(fluorescin iso-thiocyanate,FITC)標(biāo)記的羊抗鼠單克降抗體(美國(guó)Jackson lab)40μl,置4℃濕盒,冷育12 h。將標(biāo)記好的細(xì)胞標(biāo)本依次置于ZeissLSM510META激光共聚焦顯微鏡上,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)被標(biāo)記的Ⅲ型前膠原蛋白的熒光強(qiáng)度(儀器參數(shù)如下:Scan Mode:Plane;Scaling:X:0.88μm,Y:0.88μm;Stack Size:X:900μm,Y:900μm;Scan Z oom:1.0;Objective:ECPlan-Neofluar 10×/0.30M27;Average:Line 2;Pinhole:Ch2:170μm;Filters:Ch2:BP 505-530;Beam Splitters:MBS:HFT488,DBS1:Mirror,DBS2:Mirror,FW1:None;Wavelength:488 nm,80.2%)。選取細(xì)胞區(qū)域,儀器自動(dòng)讀出熒光強(qiáng)度值(每平方微米數(shù)值),取3皿之平均值作為該例標(biāo)本的熒光強(qiáng)度值。共檢測(cè)10例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TPO對(duì)基質(zhì)細(xì)胞 RPI的影響

細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)加入2μg/L至200μg/L TPO作用14 d時(shí),隨著體系內(nèi)加入TPO濃度的增加,RPI也增高(P<0.01),但劑量高于200μg/L后,這種作用不明顯(P>0.05)。說(shuō)明在一定濃度下,TPO對(duì)基質(zhì)細(xì)胞有增殖刺激作用(圖1)。

Fig.1 Effects of different concentration of rhTPO on RPI of bone marrow stromal cells

2.2 同一TPO濃度不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)基質(zhì)細(xì)胞RPI的影響

細(xì)胞在200μg/L TPO的作用下,培養(yǎng)14 d,21 d,28 d,35 d,42 d,常規(guī)胰酶-EDT A消化,重新懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)液再培養(yǎng)3 d,行MTT試驗(yàn)。結(jié)果表明細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)含200μg/L的TPO時(shí),在14 d至42 d內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)基質(zhì)細(xì)胞RPI差異不明顯(P>0.05,圖2)。

Fig.2 Effects of different exposure time on RPI of bone marrow stromal cells at the same rhTPO concentration

2.3 基質(zhì)細(xì)胞纖維連接素、層粘素和Ⅳ型膠原表達(dá)

14 d至42 d的貼壁細(xì)胞,進(jìn)行纖維連接素、層粘素和Ⅳ型膠原檢查,對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組均有陽(yáng)性表達(dá),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞陽(yáng)性強(qiáng)度(++)高于對(duì)照組細(xì)胞陽(yáng)性強(qiáng)度(+),這些分子的表達(dá)強(qiáng)度并沒(méi)有隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。培養(yǎng)14 d時(shí)免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 TPO對(duì)基質(zhì)細(xì)胞Ⅲ型前膠原蛋白合成的影響

本實(shí)驗(yàn)成功地用熒光清晰標(biāo)記并顯示出了基質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞)內(nèi)的Ⅲ型前膠原蛋白,詳見(jiàn)圖4。對(duì)照組、T1組和T3組的平均熒光強(qiáng)度值分別為(922.15±167.87)、(1099.49±113.29)和(1231.62±193.73)(每平方微米數(shù)值,共10例)。T1組與對(duì)照組比較,差異顯著(t=2.77,P=0.0126),T3組與對(duì)照組進(jìn)行比較,差異非常顯著(t=3.82,P=0.0013),T1組和T3組比較,差異不顯著(t=1.86,P=0.079)。說(shuō)明TPO能促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ⅲ型前膠原蛋白的合成,這種作用的強(qiáng)弱與TPO濃度相關(guān)性不強(qiáng)。

3 討論

Fig.3 Immunohistochemical examination of bone marrow stromal cells on day 14(10×100)

Fig.4 Fluorescence in bone marrow stromal cells in group C,T1 and T3

TPO除能調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞的增殖、分化、成熟并分裂形成有功能的血小板外,也能促進(jìn)臍血造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增,增加粒單系、紅系等集落生長(zhǎng),增加細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù),有效擴(kuò)增臍血細(xì)胞為巨核前體細(xì)胞及巨核系集落形成[10]。TPO體內(nèi)應(yīng)用后產(chǎn)生骨髓纖維化已被人們認(rèn)識(shí),但一般認(rèn)為是通過(guò)巨核細(xì)胞等系統(tǒng)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子介導(dǎo)的,TPO對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(主要為成纖維細(xì)胞)有無(wú)直接的刺激作用,尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

本研究表明,TPO可刺激基質(zhì)細(xì)胞增殖,RPI隨TPO濃度增加而增強(qiáng),不隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加。推測(cè)機(jī)制為一旦靜止的基質(zhì)細(xì)胞被TPO激發(fā)進(jìn)入增殖周期,就能維持這種活性。TPO劑量增加,被激發(fā)進(jìn)入細(xì)胞增殖周期的細(xì)胞數(shù)量也增加,故TPO對(duì)基質(zhì)細(xì)胞RPI的作用與劑量相關(guān),與作用時(shí)間無(wú)關(guān)。但基質(zhì)細(xì)胞增殖活性提高是否會(huì)促進(jìn)骨髓纖維化形成,尚無(wú)研究資料。

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),纖維連接素和層粘素染色在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均顯示為陽(yáng)性,但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞陽(yáng)性更強(qiáng),且這種陽(yáng)性并沒(méi)有隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。正如大家所知,纖維連接素是結(jié)締組織的主要成份之一,也是成纖維細(xì)胞的趨化和活性因子。層粘素是細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)分子,也是重要的信號(hào)分子。這兩種分子表達(dá)增加說(shuō)明TPO可直接刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)。另外,TPO作用后基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ⅲ型前膠原蛋白合成增加,Ⅳ型膠原表達(dá)也增加,證明TPO能直接刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞膠原合成和分泌。

我們的體外實(shí)驗(yàn)表明,TPO除通過(guò)巨核細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的細(xì)胞因子作用于基質(zhì)細(xì)胞外,也能直接刺激基質(zhì)細(xì)胞,促進(jìn)纖維形成。我們推測(cè),基質(zhì)細(xì)胞表面可能也具有TPO受體,但這需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。另外,基質(zhì)細(xì)胞是由多種類型細(xì)胞組成的復(fù)雜細(xì)胞群,TPO也可能先作用于其中的某些細(xì)胞,使其產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,進(jìn)而作用于成纖維細(xì)胞,促進(jìn)其纖維形成。將來(lái)應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)培養(yǎng)液內(nèi) TGF-β1、IL-1等細(xì)胞因子的含量,以證實(shí)這一推斷。

感謝中國(guó)沈陽(yáng)三生制藥有限責(zé)任公司為本實(shí)驗(yàn)提供重組人促血小板生成素注射液。

[1]Yanagida M,Ide Y,Imai A,et al.The role of transforming growth factor-βin PEG-rHuMG DF-induced reversible myelofibrosis in rats[J].Br J Haematol,1997,99(4):739-745.

[2]Kakumitsu H,Kamezaki K,Shimoda,K,et al.Transgenic mice overexpressing murine thrombopoietin develop myelofi-brosis and osteosclerosis[J].Leu Res,2005,29(7):761-769.

[3]Wagner-Ballon O,Chagraoui H,Prina E,et al.Monocyte/macrophage dysfunctions do not impair the promotion of myelofibrosis by high levels of thrombopoietin[J].J Immunol,2006,176(11):6425-6433.

[4]Douglas V K,Tallman M S,Crige L D,et al.Thrombopoietin administered during induction chemotherapy to patients with acute myeloid leukemia induces transient morphologic changes that may resemble chronic myeloproliferative disorders[J].Am J Clin Pathol,2002,117(6):844-850.

[5]Chagraoui H,K omura E,Tulliez M,et al.Prominent role of TGF-β1 in thrombopoietin-induced myelofibrosis in mice[J].Blood,2002,100(10):3495-3503.

[6]Martyre M C,Romquin N,Le Bousse-Kerdiles M C,et al.Transforming growth factor-βand megakaryocytes in the pathogenesis of idiopathic myelofibrosis[J].Br J Haematol,1994,88(1):9-16.

[7]Villeval J L,Cohen-solal k,Tulliez M,et al.High thrombopoietin production by hematopoietic cells induces a fatal myeloproliferative syndrome in mice[J].Blood,1997,90(11):4369-4383.

[8]黃友章,楊平地,沈建良,等.來(lái)源于骨髓和臍帶血的基質(zhì)細(xì)胞基本特性的比較[J].北京醫(yī)學(xué),2002,24(6):399-402.

[9]楊東元,羅錦輝,高建華,等.分類檢測(cè)定量病理性瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)前膠原蛋白方法的改進(jìn)與探討[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2000,9(6):407-409.

[9]Piacibello W,Sanavio F,Garetto L,et al.Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplificationvsproliferation and differentiation[J].Leukemia,1998,12(5):718-727.