劉 芳，張建新，李蘭芳，張勤增，丁艷艷，張新艷

(河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥研室，石家莊 050021)

心肌缺血指冠狀動脈供血絕對或相對不足或冠狀動脈供血中斷而導(dǎo)致心肌急性暫時性的或者持久性的缺血缺氧，從而導(dǎo)致心肌功能紊亂并伴有嚴(yán)重的細(xì)胞損傷;然而在心肌細(xì)胞的損傷和死亡中，線粒體首當(dāng)其害。線粒體是生物能量代謝的重要場所，對維持細(xì)胞的功能和代謝具有重要作用。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)為一種小分子氣體，具有不通過受體發(fā)揮作用、由內(nèi)源性關(guān)鍵酶調(diào)節(jié)生成、生理濃度時具有特殊作用等特點，是一種新型氣體信號分子[1]，在機體內(nèi)發(fā)揮著調(diào)節(jié)生理及病理生理的重要作用。研究顯示，硫氫化鈉后處理可以調(diào)控缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞線粒體滲透性轉(zhuǎn)換，阻止線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開放，減輕缺氧/復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞損傷[2]。而H2S對急性心肌缺血大鼠心肌線粒體是否存在影響有待探討。本實驗研究旨在通過建立大鼠急性心肌缺血模型，觀察H2S對急性心肌缺血大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響，探討H2S對急性心肌缺血大鼠線粒體損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物與藥品

雄性SD大鼠(250～300g)由河北省實驗動物中心提供。NaHS和PPG均購自美國Sigma公司;甲氮甲唑蘭(MTT)購自北京索萊寶科技有限公司;ATP酶、MDA、SOD和GSH-PX測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 實驗動物分組及模型制備

健康雄性SD大鼠48只，隨機分為6組(n=8):⑴假手術(shù)組(sham)、⑵缺血組(ischemia)、⑶缺血組+NaHS低劑量組(I+L NaHS)、⑷缺血+NaHS中劑量組(I+M NaHS)、⑸缺血+NaHS高劑量組(I+H NaHS)、⑹缺血+PPG組(I+PPG)。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350mg/kg)麻醉后取仰臥位固定;消毒后沿胸骨左緣3、4肋間開胸，剪開心包膜，暴露心臟，輕壓胸壁將心臟擠出，在室間溝處左心耳下方穿線，結(jié)扎左冠狀動脈前降支后將心臟回納入胸腔，記錄心電圖，觀察ST段的改變，ST段抬高≥0.15mv表示造模成功。假手術(shù)組:只穿線不結(jié)扎;缺血組:于術(shù)后3 h時腹腔注射生理鹽水(2 ml/kg);缺血+NaHS低、中、高劑量組:分別于術(shù)后3 h時腹腔注射0.78、1.56、3.12 mg/kg的NaHS(用前半小時生理鹽水新鮮配置，均為2 ml/kg)，缺血+PPG組于術(shù)后3 h時腹腔注射30mg/kg的PPG(2ml/kg)。各組動物均在術(shù)后6 h時經(jīng)右頸總動脈取血后處死、取材備用。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 術(shù)后6 h摘取大鼠心臟，取心尖，4%戊二醛固定，H-7500型透射電鏡下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.2 血漿中H2S含量的測定[3]采用去蛋白的方法，在預(yù)先準(zhǔn)備好的試管中加入0.5 ml 1%醋酸鋅后加入0.1ml血漿標(biāo)本，振蕩混勻，再依次加入0.5 ml 20mmol/L對苯二胺鹽酸鹽和0.4 ml 30mmol/L三氯化鐵，室溫孵育20min，使之充分顯色。加入1 ml 10%三氯醋酸，用蒸餾水補足體積至5ml。6000r/min離心5min，吸取上清液，測上清液在670nm波長處吸光度值，根據(jù)NaHS標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿中H2S的含量，結(jié)果以μmol/L表示。

1.3.3 心肌組織中胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)活性的測定[3]采用亞甲基藍(lán)方法，取左心室前壁部分組織，在預(yù)冷的生理鹽水中洗去殘血，濾紙吸干。分析天平分別稱量所取心肌組織質(zhì)量，按10%質(zhì)量體積比加入預(yù)冷的磷酸鉀緩沖液(50mmol/L，pH 6.8)，用電動勻漿器制成勻漿后于4℃、4000r/min離心10min，吸取上清0.3 ml做為反應(yīng)液，測定心肌組織CSE活性。用分光光度計在波長670nm處檢測各樣本反應(yīng)后吸光度值，組織中CSE活性以每毫克組織在單位時間內(nèi)生成H2S的量表示，單位為mmol/(min?mg)。

1.3.4 心肌線粒體活力、膜腫脹度，以及總ATP酶、GSH-PX、SOD活性和MDA含量測定 采用差速離心法提取心肌線粒體[4]。取左室前壁組織約0.5 g，剪碎，按1∶9(質(zhì)量體積比)加入帶有冰渣的分離介質(zhì)A(70mmol/L蔗糖，210mmol/L甘露醇，1 mmol/L EDTA，50mmol/L Tris-HCl pH 7.4)冰浴中勻漿。勻漿液1300r/min離心3 min，取上清，10000r/min離心8min，取沉淀，重新懸浮于介質(zhì)B(70mmol/L蔗糖，210mmol/L甘露醇，50mmol/L Tris-HCl pH 7.4)中，再以同樣速度離心10min后得到的沉淀為心肌線粒體。整個過程控制在1 h以內(nèi)，溫度保持0～4℃。沉淀加入1 ml分離介質(zhì)B制成線粒體懸液，考馬斯亮蘭法測蛋白含量。

取新鮮制備的線粒體懸液100μl，加入酶標(biāo)板微孔中，加入5 g/L甲氮甲唑藍(lán)40μl，30℃繼續(xù)孵育30min，再加入 100μl異丙醇 20min 后于酶聯(lián)免疫檢測儀570nm比色，OD570值大小表示線粒體活力。

取新鮮制備線粒體，反應(yīng)前4℃放置。反應(yīng)緩沖液(蔗糖250mmol/L、KH2PO45 mmol/L、琥珀酸鈉3 mmol/L，pH 7.2)，加入線粒體懸液，調(diào)整線粒體蛋白含量為0.5 mg/ml，于722分光光度計上540nm處測定吸光度數(shù)值(OD540)[4]，反應(yīng)條件保持25℃恒溫。

ATP酶可分解ATP生成ADP及無機磷，測定無機磷的量可判斷ATP酶活性的高低。ATP酶活力單位以每小時分解每毫克組織蛋白產(chǎn)生的無機磷(Pi)的含量(μmol)來表示。具體方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

測定GSH-PX活性測定采用二硫代二硝基苯甲酸比色法，SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法。具體操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)的變化

假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞核周隙稍擴張，肌原纖維排列整齊、清晰;線粒體膜完整，部分輕度水腫，嵴清晰。缺血組大鼠心肌細(xì)胞核周隙擴張，核膜部分溶解消失;線粒體嵴和膜排列紊亂，部分溶合，線粒體空泡化，糖原顆粒明顯減少。與缺血組相比，缺血+NaHS各組大鼠心肌損傷明顯減輕，尤以高劑量組減輕明顯，線粒體膜結(jié)構(gòu)完整，僅輕度水腫，嵴清晰，可見糖原顆粒。缺血+PPG組大鼠心肌損傷加重，核質(zhì)和核周胞質(zhì)高度水腫，核周肌原纖維消失;線粒體嚴(yán)重腫脹變形，嵴和膜融合消失，空泡樣變(圖1)。

Fig.1 Pathological changes of ultrastructure of myocardium by electron microscope(×15 k)

2.2 大鼠H2S/CSE體系變化

與假手術(shù)組比較，缺血組大鼠血漿H2S含量和心組織中CSE活性降低(P＜0.01);與缺血組比較，缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠血漿H2S含量和心組織中CSE活性均升高，缺血+PPG組大鼠血漿H2S含量和心組織中CSE活性均降低(P＜0.05或P＜0.01，表1)。

Tab.1 Changes of the content of H2S in plasma and the activity of CSE in myocardial tissue of rats(，n=8)

Tab.1 Changes of the content of H2S in plasma and the activity of CSE in myocardial tissue of rats(，n=8)

I+L NaHS:Ischemia+0.78mg/kg NaHS;I+M NaHS:Ischemia+1.56 mg/kg NaHS;I+H NaHS:Ischemia+3.12 mg/kg NaHS;I+PPG:Ischemia+30mg/kg PPG**P＜0.01 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ischemia

Group H2S(μmol/L)CSE(mmol/(min?mg))Sham 23.65±2.32 2.93±0.24 Ischemia 14.87±2.06** 1.80±0.18**I+L NaHS 17.56±2.45# 2.10±0.22#I+M NaHS 20.14±1.77## 2.34±0.21##I+H NaHS 22.48±1.58## 2.64±0.23##I+PPG 10.89±1.99## 1.42±0.26##

2.3 H2S對大鼠心肌線粒體活力、膜腫脹度，以及總ATP酶、GSH-PX、SOD活性和 MDA含量

線粒體活力以加入MTT后570nm處吸光度值表示，線粒體膜腫脹表現(xiàn)為540nm處吸光度值下降。與假手術(shù)組比較，缺血組大鼠心肌線粒體OD540、OD570值下降(P＜0.01)。與缺血組比較，缺血+NaHS中、高劑量組大鼠心肌線粒體OD540值明顯高于缺血組(P＜0.05或 P＜0.01);缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠心肌線粒體OD570值明顯高于缺血組(P＜0.05或P＜0.01);而缺血+PPG組大鼠心肌線粒體OD570、OD540值下降(P＜0.05，表2)。

與假手術(shù)組比較，缺血組大鼠心肌線粒體中MDA含量明顯升高，ATP酶、SOD、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)。與缺血組相比，缺血+NaHS中、高劑量組大鼠MDA含量明顯減少(P＜0.05或P＜0.01);缺血+NaHS低、中、高劑量組大鼠ATP酶、SOD、GSH-Px活性明顯升高(P＜0.05或 P＜0.01);缺血+PPG組大鼠心肌線粒體中MDA含量明顯升高，ATP酶、SOD、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.05或P＜0.01，表2，3)。

3 討論

隨著人們對H2S的深入研究發(fā)現(xiàn)，它不再單單是一種對人體有害的氣體，而是在體內(nèi)，尤其是在心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的生理作用[5]。

我們根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[3，6，7]以及前期實驗和預(yù)實驗結(jié)果，分別在急性缺血3 h后腹腔注射 0.78、1.56、3.12 mg/kg的NaHS及30mg/kg的PPG(CSE酶抑制劑)，結(jié)果顯示在此劑量對急性心肌缺血損傷有較好的治療或加重作用，因此選擇上述劑量分別觀察了其對急性心肌缺血的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，急性缺血后大鼠心肌線粒體明顯腫脹，部分空泡狀改變，部分破裂溶解;而且血漿中H2S含量和心肌CSE活性降低。給予NaHS后大鼠心肌線粒體損傷減輕，血漿中H2S含量和心肌CSE活性升高;而給予CSE抑制劑PPG后大鼠心肌線粒體損傷加重。提示給予外源性H2S可明顯減輕急性心肌缺血時線粒體損傷，進(jìn)而減輕急性心肌缺血時心肌損傷。

Tab.2 Effect of H2S on the swelling，activity of mitochondria and content of MDA in myocardium mitochondrial in acute myocardial ischemia in rats(，n=8)

Tab.2 Effect of H2S on the swelling，activity of mitochondria and content of MDA in myocardium mitochondrial in acute myocardial ischemia in rats(，n=8)

I+L NaHS:Ischemia+0.78mg/kg NaHS;I+M NaHS:Ischemia+1.56mg/kg NaHS，I+H NaHS:Ischemia+3.12 mg/kg NaHS;I+PPG:Ischemia+30mg/kg PPG**P＜0.01 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ischemia

Group Swelling of mitochondria(OD540)Activity of mitochondria(OD570)MDA(nmol/mg pro)Sham 0.351±0.037 0.421±0.048 2.70±0.45 Ischemia 0.220±0.027** 0.276±0.030** 5.36±0.62**I+L NaHS 0.235±0.028 0.324±0.027# 4.84±0.46 I+M NaHS 0.268±0.033# 0.353±0.035## 4.54±0.33#I+H NaHS 0.307±0.036## 0.381±0.040## 4.17±0.43##I+PPG 0.178±0.021# 0.229±0.023# 6.61±0.72##

Tab.3 Effect of H2S on activities of mitochondria ATPase，SOD，GSH-Px in myocardium mitochondria in acute myocardial ischemia in rats(，n=8)

Tab.3 Effect of H2S on activities of mitochondria ATPase，SOD，GSH-Px in myocardium mitochondria in acute myocardial ischemia in rats(，n=8)

I+L NaHS:Ischemia+0.78mg/kg NaHS;I+M NaHS:Ischemia+1.56 mg/kg NaHS;I+H NaHS:Ischemia+3.12mg/kg NaHS;I+PPG:Ischemia+30mg/kg PPG**P＜0.01 vs sham;#P＜0.05，##P＜0.01 vs ischemia

Group ATPase(U/mg pro)SOD(U/mg pro)GSH-Px(U/mg pro)Sham 6.44±0.81 26.13±2.27 20.13±2.71 Ischemia 4.63±0.92** 11.37±1.72** 10.43±2.16**I+L NaHS 5.63±0.56# 14.27±1.78# 13.58±2.05#I+M NaHS 5.72±0.56# 16.40±2.37## 14.28±2.31##I+H NaHS 6.20±0.66## 19.71±2.56## 17.01±2.63##I+PPG 3.62±0.92# 8.18±2.20# 7.13±2.13#

線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種重要而獨特的細(xì)胞器，是生物能量代謝的重要場所。心肌為高代謝組織，心肌細(xì)胞線粒體含量占細(xì)胞容積的30%以上，以適應(yīng)其較高的能量需求。因此，心肌細(xì)胞線粒體的功能狀態(tài)對心肌缺氧耐受性及缺氧后收縮功能恢復(fù)至關(guān)重要。

生理狀態(tài)下，線粒體SOD，GSH-Px含量豐富，可及時清除代謝產(chǎn)生的氧自由基;而心肌缺血后產(chǎn)生大量的氧自由基，可造成線粒體SOD，GSH-Px消耗增多而活性降低，同時還可使線粒體內(nèi)MDA含量升高，而MDA可與線粒體的膜脂、膜蛋白形成交聯(lián)，使膜流動性降低[8]，進(jìn)而影響線粒體的電子傳遞和磷酸化過程，導(dǎo)致ATP酶活性下降，使ATP合成減少，影響細(xì)胞的功能。此外，氧自由基還可損傷線粒體膜，引起線粒體膜通透性改變，導(dǎo)致線粒體內(nèi)Ca2+超載，而氧自由基、Ca2+超載等又能誘導(dǎo)線粒體膜通透性改變，形成惡性循環(huán)，加重?fù)p傷。缺血預(yù)處理可改善大鼠離體心臟缺血再灌注心肌線粒體的功能[9]，可能通過激活線粒體KATP通道，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，阻止過度的線粒體基質(zhì)收縮，提高線粒體再灌注期間氧化磷酸化效能，減少缺血期高能磷酸化合物丟失，從而減輕缺血再灌注心肌的損傷[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌缺血后心肌線粒體膜腫脹，活力下降，MDA含量升高，而心肌線粒體ATP酶、SOD和GSH-Px的活性減弱，這表明急性心肌缺血后心肌線粒體能量供應(yīng)受損。而給予NaHS后，減輕了心肌線粒體膜腫脹，使線粒體活力有所恢復(fù)，并且增強了心肌線粒體ATP酶、SOD和GSH-Px的活性，降低了線粒體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平，從而保證線粒體的正常氧化和產(chǎn)能功能，明顯減輕心肌缺血損傷;而給予胱硫醚-γ-裂解酶抑制劑PPG后心肌線粒體膜腫脹加重，活力進(jìn)一步下降，且線粒體中MDA含量升高，而ATP酶、SOD和GSH-Px的活性減弱，再次證明H2S對急性心肌缺血時心肌線粒體有保護(hù)作用。

總之，急性心肌缺血時大鼠心肌線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，給予外源性H2S可增強心肌線粒體ATP酶、SOD、GSH-Px的活性，降低線粒體脂質(zhì)過氧化水平，從而起到對急性心肌缺血大鼠心肌的保護(hù)作用。

[1]Wang R.Two's company，three's acrowd:can H2S be the third endogenousgaseous transmitter[J].FASEBJ，2002，16(13):1792-1798.

[2]汪 莉，徐 鋼，季 永，等.硫氫化鈉后處理對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞線粒體滲透性轉(zhuǎn)換的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2008，24(12):1610-1614.

[3]王 平，張建新，李蘭芳，等.硫化氫對大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷的影響[J].中國藥理學(xué)通報，2008，24(9):1232-1236.

[4]解麗君，張建新，李蘭芳.異丙酚對離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷后細(xì)胞凋亡及其機制研究[J].中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2008，24(1):56-61.

[5]Hu X，Li T，Bi S，et al.Possible Role of HydrogenSulfide on the Preservation of Donor Rat Hearts[J].Transplantat Proc，2007，39(10):3024-3029.

[6]Zhu Y Z，Wang Z J，Ho P，et al.Hydrogen sulfide and its possible rolesinmyocardial ischemia inexperimental rats[J].J Appl Physiol，2007，102(1):261-268.

[7]徐 鋼，季 永，汪 莉，等.內(nèi)源性硫化氫參與缺血后處理減輕離體大鼠心臟缺血/再灌注損傷[J].中國藥理學(xué)通報，2008，24(7):910-914.

[8]Oddis C V，F(xiàn)inkel M S.Cytokine-stimulated nitric oxide production inhibits mitochondrial activity in cardiac myocytes[J].Biochem Biophys Res Commun，1995，213(3):1002-1009.

[9]張 瓊，喻 田，傅小云，等.缺血預(yù)處理對大鼠離體心臟心肌線粒體功能的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2007，27(8):745-747.

[10]Korge P，Honda H M，Weiss J N.K+-dependent regulation of matrix volume improves mitochondrial function under conditions mimicking ischemia-reperfusion[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289(1):H66-77.