王振富

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，恩施 445000)

心肌缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion ingruy，I/R)在臨床上常見(jiàn)于急性心梗再灌注初期、冠脈內(nèi)溶栓術(shù)、動(dòng)脈搭橋術(shù)等過(guò)程中，主要表現(xiàn)為再灌注性心肌損傷、心律失常和心功能低下。其機(jī)理復(fù)雜，目前認(rèn)為與再灌注后細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、氧自由基大量生成、微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞、血小板之間相互作用等有關(guān)[1]。近年來(lái)，大量基礎(chǔ)研究表明，中藥參附注射液可通過(guò)多種途徑對(duì)缺血再灌注損傷有保護(hù)作用[2]，在臨床上常用于休克、心力衰竭、心律失常和急性心肌梗塞等的治療[3～6]。筆者為了進(jìn)一步探討參附注射液對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，建立了家兔急性心肌缺血再灌注模型，通過(guò)血流動(dòng)力學(xué)和酶學(xué)作了相關(guān)研究，為參附注射液用于防治心血管系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)和參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

參附注射液(主要成分為人參皂甙和烏頭堿，濃度分別為0.8 g/L和0.1 g/L，批號(hào) 00202)由雅安三九藥業(yè)有限公司提供;乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)試劑盒均為山東濰坊3 V生物工程集團(tuán)有限公司提供;丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷光甘肽過(guò)氧化物酶(glutathine peroxidease，GSH-PX)及ATP試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供;組織蛋白定量測(cè)定試劑盒由Bioresun公司提供;AEROSET 09D05-01全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó))，Acuson Sequoia 512型彩色多普肋超聲儀(美國(guó))。

1.2 模型制備與實(shí)驗(yàn)分組

雄性家兔(由湖北民族學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，4～5月齡，體重2.1～2.5 kg。將30只家兔隨機(jī)分成3組(n=10):對(duì)照組、心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury MI/RI)組和參附注射液組。取家兔，用20%烏拉坦(5 ml/kg)做靜脈麻醉后仰臥于家兔手術(shù)臺(tái)固定，頸部除毛，作頸正中切口，行氣管插管術(shù)，以呼吸機(jī)維持規(guī)律呼吸;經(jīng)左頸總動(dòng)脈插管至左心室檢測(cè)心功能，股動(dòng)脈插管檢測(cè)動(dòng)脈血壓，導(dǎo)管經(jīng)壓力傳感器連于多普肋超聲儀分析記錄系統(tǒng)顯示左室壓力和動(dòng)脈壓;暴露右頸總動(dòng)脈套置與血管直徑約相等的探頭連接于多普肋超聲儀檢測(cè)血流量;胸部除毛，于3、4肋間開(kāi)胸縫制心包床，充分暴露心臟于冠狀動(dòng)脈左心室支上1/3處穿“0”號(hào)醫(yī)用縫合線結(jié)扎，致缺血60min后剪開(kāi)結(jié)扎線重新灌注100min，造成心肌缺血再灌注(MI/RI)模型。模型復(fù)制的可靠性用心電圖連續(xù)監(jiān)視標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)(ECG)Ⅱ的變化來(lái)判斷，以ST段抬高為心肌缺血存在，以深大Q波出現(xiàn)確定再灌注損傷形成。對(duì)照組于冠狀動(dòng)脈左心室支上1/3處只穿線不結(jié)扎。參附注射液組按劑量(10mg/kg bw)標(biāo)準(zhǔn)于缺血前10min經(jīng)右頸內(nèi)靜脈注射參附注射液，對(duì)照組與MI/RI組于相同時(shí)間給予同等體積的生理鹽水注射。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 一般生理指標(biāo)測(cè)定 心率(heart rate，HR)，平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)，左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、±dp/dtmax和左室舒張末期壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)，頸動(dòng)脈血流量(carotid blood flow ，CBF)均采用多普肋超聲儀生物信號(hào)記錄系統(tǒng)檢測(cè)。

1.3.2 心肌組織中氧自由基和酶 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速處死動(dòng)物，摘取心臟切取左心室結(jié)扎線以下缺血區(qū)心肌組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗除去血液，濾紙吸干稱重，加9倍生理鹽水，在低溫(冰水)中用玻璃研磨器研磨制成10%的組織勻漿，高速離心，取上清液冷凍保存待測(cè)。采用雙縮脲法行組織蛋白定量，采用硫代巴比妥酸顯色法檢測(cè)MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD，二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定GSH-PX，LDH、CK采用國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)推薦的方法檢測(cè)，檢測(cè)步驟均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 ATP酶 利用ATP酶可分解ATP生成ADP及無(wú)機(jī)磷，通過(guò)測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量可判斷ATP酶活性的高低，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)中步驟進(jìn)行測(cè)定，酶活力單位以每小時(shí)每克組織蛋白(g pro)產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷(Pi)含量(mmol)來(lái)表示 ，即 mmolPi/(g pro?h)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 參附注射液對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響

缺血前，各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)無(wú)明顯差異;缺血期及再灌注時(shí)，除對(duì)照組外，MI/RI組和參附注射液的 HR 、MAP 、CBF 、TAMA 、LVSP 、±dp/dtmax均下降 ，其中MI/RI組變化最為顯著，而參附注射液至再灌注100min時(shí)各項(xiàng)功能指標(biāo)有明顯恢復(fù)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。

Tab.1 Effects of Shenfu injections on hemodynamics after 100min of myocardial ischemia/reperfusion injury(，n=10)

Tab.1 Effects of Shenfu injections on hemodynamics after 100min of myocardial ischemia/reperfusion injury(，n=10)

HR:Heart rate;MAP:Mean arterial pressure;CBF:Carotid blood flow;LVSP:Left ventricular systolic pressure;LVEDP:Left ventricular end-diastolic pressure;MI/RI:Myocardial ischemia/reperfusion injury**P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs MI/RI

Group HR(time/min)MAP(kpa)CBF(ml/min)LVSP(kpa)LVEDP(kpa)±dp/dtmax(kpa.s)Control 253±21 17.2±1.1 62.0±5.1 12.8±1.2 0.64±0.13 341.1±35.4 MI/RI 198±25** 12.4±1.5** 41.5±6.1** 6.9±1.4** 1.16±0.15** 236.2±34.7**Shenfu injections 227±18# 14.5±1.4# 52.4±6.4# 10.9±1.7## 0.85±0.16## 274.4±29.5##

2.2 參附注射液對(duì)心肌組織中MDA、SOD、GSHPX的影響

與對(duì)照組比較，MI/RI組MDA含量明顯升高，SOD、GSH-PX活性明顯降低，組間差異有顯著性(P＜0.01);與MIRI組比較，參附注射液組各項(xiàng)指標(biāo)有明顯的恢復(fù)(P＜0.01，表2)。

Tab.2 Effects of Shenfu injections on MDA and SOD and GSH-PX(，n=10)

Tab.2 Effects of Shenfu injections on MDA and SOD and GSH-PX(，n=10)

MDA:Malonaldehyde;SOD:Superoxide dismutase;GSHPX:Glutathione peroxidase**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs MI/RI

Group MDA(nmol/mg pro)SOD(Nu/mg pro)GSH-PX(U/g pro)Control 1.81±0.67 274.55±37.61 20.74±3.22 MI/RI 3.12±0.71** 135.29±28.07** 11.19±2.84**Shenfu injections2.24±0.64## 225.48±42.02## 15.58±3.17##

2.3 參附注射液對(duì)心肌LDH、CK、ATP酶活力的影響

與對(duì)照組比較，MI/RI組LDH、CK活性升高，Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase明顯降低，組間差異有顯著性(P＜0.01);與MI/RI組比較，參附注射液組各項(xiàng)指標(biāo)有明顯的恢復(fù)(P＜0.05，P＜0.01，表3)。

Tab.3 Effects of Shenfu injections on LDH and CK and ATP enzyme(，n=10)

Tab.3 Effects of Shenfu injections on LDH and CK and ATP enzyme(，n=10)

LDH:Lactic dehydrogenase;CK:Creatine kinase**P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs MI/RI

Group LDH(U/L)CK(U/L)Ca2+-ATPase mmolPi/(g pro?h)Na+-K+-ATPase mmolPi/(g pro?h)Control 115.26±17.62 194.31±29.37 1.62±0.58 4.12±0.34 MI/RI 232.69±30.58** 354.77±41.24** 0.74±0.35** 1.31±0.51**Shenfu injections 144.39±24.71## 321.68±48.34# 0.88±0.34# 2.87±0.61##

3 討論

鈣超載是缺血再灌注過(guò)程中損傷心肌細(xì)胞的一個(gè)主要因素，其中調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+、Na+離子平衡的細(xì)胞質(zhì)膜上Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase起著重要作用[7～8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌缺血再灌注損傷后，參附注射液明顯促進(jìn)Ca2+-ATPase活性恢復(fù)，增強(qiáng)Na+-K+-ATPase活力，這將有利于減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，或通過(guò)Na+-K+-ATPase調(diào)節(jié)Na+-H+交換來(lái)抑制Na+-Ca2+交換，阻止細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，從而改善心肌組織中的能量代謝活動(dòng)，阻止能量衰竭的發(fā)生，從而達(dá)到對(duì)心肌保護(hù)的作用。氧自由基是心肌缺血再灌注后受損傷的主要原因，參附注射液能明顯抑制心肌缺血再灌注損傷后LDH、CK酶的釋放，減少M(fèi)DA含量，增強(qiáng)SOD活力，說(shuō)明參附注射液具有營(yíng)養(yǎng)心肌保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，既可直接清除自由基，又可通過(guò)提高SOD活力來(lái)增加機(jī)體抗氧化能力。參附注射液對(duì)缺血期的心功能沒(méi)有明顯改善作用，保護(hù)作用主要體現(xiàn)在再灌注期，再灌注過(guò)程中心功能重要指標(biāo)明顯恢復(fù)，各項(xiàng)血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)HR、MAP及CBF處于回升狀態(tài)，心律失常發(fā)生率明顯減少，說(shuō)明參附注射液對(duì)缺血/再灌注損傷后的心肌組織有營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用，能夠調(diào)節(jié)心肌收縮力，增強(qiáng)心臟泵血功能，增加心輸出量。

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