趙 津，史中立Δ，齊萬(wàn)爭(zhēng)，朱振龍

(1.河北醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，2.附屬第一醫(yī)院病理科，石家莊 050017)

在地震、塌方造成的損傷中，肢體擠壓傷占有較高的比例。解除擠壓、恢復(fù)肢體供血是現(xiàn)場(chǎng)救治的首要步驟。然而，恢復(fù)供血所引發(fā)的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷，常導(dǎo)致保肢治療失敗甚至危及傷者生命。因此，防治肢體I/R損傷是整體救治的重要環(huán)節(jié)。我們前期的研究證實(shí)，吸入適量一氧化碳(carbon monoxide，CO)可顯著減輕肢體I/R損傷及其引發(fā)的肝臟損傷，但所用動(dòng)物模型的肢體缺血時(shí)間為4h，缺血程度相對(duì)較輕[1，2]。肢體嚴(yán)重缺血者，再灌注后常伴有血壓下降甚至出現(xiàn)休克的表現(xiàn)，CO兼有舒張血管的效應(yīng)，吸入CO對(duì)肢體嚴(yán)重I/R損傷有何影響尚缺乏研究。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

全自動(dòng)生化分析儀LX-20(Beckman Coulter)，無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)(成都儀器廠)，CO檢測(cè)儀(FM2-MYJ型，北京中西器材公司)，OLYMPUS顯微鏡，UFX-DX顯微照相系統(tǒng)(Nikon)。含CO的醫(yī)用空氣(CO的體積分?jǐn)?shù)為0.075%，北京海溫氣體制造廠，氣瓶編號(hào) 15564、03129、247114)，血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(北京中生生物工程高技術(shù)公司)。SD大鼠(清潔級(jí))，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):冀504085)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組、肢體I/R動(dòng)物模型復(fù)制及吸入CO的方法

雄性SD大鼠36只，體重220～250g，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7 d，待動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后，將動(dòng)物隨機(jī)分為肢體 I/R12 h、10d組(n=8)、I/R12 h、10d吸入CO(RC)組(n=8)、假手術(shù)(S)組(n=4)。I/R 和RC12 h組，于再灌注12 h時(shí)取材，用于血清LDH、CK、肢體濕干重量比(wet/dry，W/D)和病理學(xué)指標(biāo)的觀測(cè)，I/R和RC10d組用于尾動(dòng)脈壓(caudal artery pressure，CAP)和 10d存活率的觀測(cè)。S組，于假手術(shù)后12 h時(shí)取材，和I/R、RC12 h組對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

I/R、RC組大鼠在6%水合氯醛(0.3 g/kg ip)全麻狀態(tài)下，剪毛消毒，切開(kāi)皮膚，在雙側(cè)后肢根部分離暴露股動(dòng)脈，無(wú)創(chuàng)血管夾將其夾閉，縫合創(chuàng)口，用橡皮筋綁扎后肢根部，使后肢缺血8 h，去除血管夾及橡皮筋行再灌注，以此復(fù)制肢體嚴(yán)重I/R損傷模型。S組大鼠于全麻下切開(kāi)皮膚，分離暴露雙側(cè)股動(dòng)脈，模擬手術(shù)過(guò)程，但不造成肢體缺血。

用于吸氣的裝置是一個(gè)特制的玻璃器皿，設(shè)有導(dǎo)入、導(dǎo)出氣體的開(kāi)口，導(dǎo)入口與儲(chǔ)氣鋼瓶通連，鋼瓶?jī)?nèi)儲(chǔ)有含 CO的醫(yī)用空氣，CO的體積分?jǐn)?shù)為0.075%。RC組于再灌注前2 h時(shí)放入吸氣器皿內(nèi)，開(kāi)始持續(xù)吸入含有CO的醫(yī)用空氣，直至再灌注后4h，共計(jì)吸入 6 h。S、I/R組暴露于空氣中，自主呼吸。

1.3 大鼠CAP及10d存活率觀測(cè)

按照無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)量分析系統(tǒng)的測(cè)定要求，每次測(cè)血壓前將大鼠在37°C環(huán)境中保溫15～20min，以使尾動(dòng)脈擴(kuò)張，將加壓套套在大鼠尾近心端處，脈搏換能器置于尾中上1/3處，換能器對(duì)準(zhǔn)尾腹面固定。待動(dòng)物穩(wěn)定后，打開(kāi)測(cè)量裝置的操作系統(tǒng)，可見(jiàn)動(dòng)脈脈搏信號(hào)出現(xiàn)。當(dāng)規(guī)律性的脈搏波出現(xiàn)后，充氣加壓使加壓套內(nèi)壓力升高到脈搏波完全消失，再加壓升高4 kPa，之后緩慢放氣，觀察讀取脈搏波及CAP。行再灌注前2 h、0h，再灌注后 2、4、6、8、10、12、13 h，各測(cè)一次，計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)CAP的平均值。在測(cè)定血壓的同時(shí)，觀察動(dòng)物的狀態(tài)，記錄死亡時(shí)間，計(jì)算10d存活率。

1.4 血清LDH和CK活性測(cè)定

各組動(dòng)物于深度全麻下，經(jīng)右心房采血5 ml，在35℃恒溫水浴箱中靜置15 min，以3000r/min的速度離心5 min，取上清液送全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH、CK活性。

1.5 肢體W/D測(cè)定

上述動(dòng)物經(jīng)心房采血后，從髖關(guān)節(jié)處截取左側(cè)后肢，用電子分析天平先稱濕重，在60℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中干燥7 d，直到組織恒重，再測(cè)量肢體干重，計(jì)算肢體W/D值。

1.6 病理學(xué)觀察

上述動(dòng)物經(jīng)心房采血后，從髖關(guān)節(jié)處截取右側(cè)后肢。先對(duì)肢體腫脹程度、皮下滲出情況及壞死粘連程度、肌肉顏色、質(zhì)地等進(jìn)行大體觀察。其后，剝?nèi)テつw，將小腿部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，把小腿三頭肌切成組織塊，石蠟包埋、切片(5μm)，HE染色，光鏡觀察肌組織病理學(xué)變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CAP和10d存活率觀測(cè)結(jié)果

I/R組，再灌注后CAP開(kāi)始下降，其過(guò)程可區(qū)分為四個(gè)時(shí)相:第一時(shí)相(再灌注0～2 h)，為血壓快速下降期，至 2 h前后，CAP均值降為(8.6708±0.5992)kPa;第二時(shí)相(再灌注2～4h)，為血壓相對(duì)穩(wěn)定期，此期下降幅度較小;第三時(shí)相(再灌注4～8 h)，為血壓緩慢下降期，此期血壓下降的速率變緩，但持續(xù)降低，至再灌注8 h時(shí)CAP均值降為(5.3259±0.3832)kPa;第四時(shí)相(再灌注8 h～死亡)，為持續(xù)低血壓期，CAP波動(dòng)在5 kPa上下，動(dòng)物處于持續(xù)休克狀態(tài)，再灌注13～14h間有6只大鼠死亡，另外2只再灌注至20h前后死亡，10d存活率為0。與I/R組比較，RC組CAP下降的過(guò)程也可區(qū)分為四個(gè)時(shí)相:第一時(shí)相，血壓下降較快，但下降幅度顯著變小，再灌注至 2 h前后，CAP均值降到(10.3843±1.3111)kPa;第三時(shí)相，CAP下降的速率和幅度均明顯降低，至再灌注 8 h時(shí) CAP均值為(8.3300±0.4224)kPa;第四時(shí)相，血壓不再下降，且穩(wěn)中有升，至再灌注13 h前后CAP均值為(9.4157±0.3305)kPa，8只大鼠中1只在再灌注至20h前后死亡，其余7只再灌注10d后仍存活，且狀態(tài)良好，10d存活率為7/8(圖1，表1)。

Fig.1 Time course of mean caudal artery pressure before and after reperfusion in different groups

Tab.1 Mean caudal artery pressures after reperfused 2，8，13 hours in different groups(kPa，，n=8)

Tab.1 Mean caudal artery pressures after reperfused 2，8，13 hours in different groups(kPa，，n=8)

I/R:Ischemia/reperfusion group;RC:I/R after CO inhalation group*P＜0.05 vs I/R group

Group 2 h 8 h 13 h I/R 8.6708±0.59925.3259±0.38325.0767±0.3677 RC 10.3843±1.3111*8.3300±0.4224*9.4157±0.3305*

2.2 血清LDH、CK活性檢測(cè)結(jié)果

血清LDH和CK活性相對(duì)值:I/R組 ＞RC組＞S組(表2)。

2.3 肢體W/D值

肢體W/D值:I/R組 ＞RC組 ＞S組(表2)。

Tab.2 Changes of limb wet/dry ratios，serum LDH and CK activities in different groups()

Tab.2 Changes of limb wet/dry ratios，serum LDH and CK activities in different groups()

S:Sham group;I/R:Ischemia/reperfusion group;RC:I/R after CO inhalation group*P＜0.05 vs S group;#P＜0.05 vs I/R group

Group n W/D LDH(U/L) CK(U/L)S 42.71±0.28 197.75±65.48 44.25±35.48 I/R 8 4.15±0.21* 561.38±85.53* 210.88±52.18*RC 8 3.60±0.25*# 389.131±46.44*# 152.50±44.66*#

2.4 病理學(xué)觀察結(jié)果

大體觀察:S組，肢體肌肉顏色暗紅，形態(tài)正常，彈性好，皮下無(wú)出血及滲出物;I/R組，肢體明顯腫脹，色澤深暗，彈性差，皮下組織內(nèi)、肌間隔內(nèi)有大量血色滲出液及大量淺黃色膠狀滲出物;RC組，肢體的腫脹程度較I/R組明顯減輕，顏色較I/R組略顯蒼白，彈性差，皮下組織、肌間隔內(nèi)血色滲出液及膠狀滲出物明顯減少(圖2)。

Fig.2 Gross observation of rat limbs in different groups

組織病理學(xué)觀察:S組，骨骼肌細(xì)胞形態(tài)正常，胞漿均勻、紅染，胞核無(wú)變形，核仁清晰;肌束明顯，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。I/R組，骨骼肌細(xì)胞胞體增大，部分肌細(xì)胞變性、壞死，肌漿溶解、破壞，胞核消失，呈空泡狀;肌束斷裂，肌細(xì)胞間有大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并見(jiàn)廣泛出血灶。RC組，可見(jiàn)肌細(xì)胞變性的程度減輕，肌漿含有空泡，呈灶狀溶解，肌細(xì)胞腫大程度減輕，肌漿、胞核染色趨近正常，未見(jiàn)核固縮;骨骼肌細(xì)胞間仍有單核細(xì)胞浸潤(rùn)，但數(shù)量減少;出血減輕(圖3)。

Fig.3 HE stain for limb skeletal muscle longitudinal surface in different groups(×100)

3 討論

臨床資料顯示，肢體擠壓時(shí)間在4h以內(nèi)者，所造成的I/R損傷相對(duì)較輕;肢體被持續(xù)擠壓6 h以上者，可同時(shí)出現(xiàn)擠壓傷和I/R損傷的表現(xiàn)，肢體肌組織嚴(yán)重腫脹、液化壞死，肢體傷殘率很高。本課題組既往的研究證實(shí)，大鼠雙側(cè)后肢缺血4h，再灌注后所引發(fā)的I/R損傷較輕，在10d觀察期內(nèi)，動(dòng)物沒(méi)有出現(xiàn)死亡[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠雙側(cè)后肢缺血8 h行再灌注，動(dòng)物血壓明顯下降，再灌注至8 h時(shí)CAP降至5 kPa上下，此后呈持續(xù)低血壓狀態(tài)，再灌注至13-14h動(dòng)物大部分死亡，10d存活率為0。該結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所復(fù)制的動(dòng)物模型是一種肢體嚴(yán)重I/R損傷模型，再灌注后血壓持續(xù)下降，直至休克死亡。

肢體被嚴(yán)重?cái)D壓后，受壓部位及遠(yuǎn)端組織因缺血缺氧代謝障礙、結(jié)構(gòu)破壞。在解除擠壓恢復(fù)供血后，組織中氧濃度急劇升高，但不能被正常代謝利用，反而衍生出大量活性氧(ROS)等有毒介質(zhì)。這些物質(zhì)將進(jìn)一步加重肢體的損傷。不僅如此，受傷肢體產(chǎn)生、釋放的有毒物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)后，可刺激激活多形核粒細(xì)胞(PMN)等血細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞活化后，表達(dá)粘附分子，引起PMN貼壁、黏附、聚集?；罨?PMN可移出血管，以“呼吸爆發(fā)”的方式產(chǎn)生釋放ROS、蛋白水解酶、髓過(guò)氧化物酶等，引起組織損傷。以上反應(yīng)呈逐級(jí)放大效應(yīng)，可激活更多的炎癥細(xì)胞參與其中。最終，因血流變學(xué)發(fā)生紊亂，導(dǎo)致受傷肢體及肝腎等臟器的微循環(huán)障礙，因大量白細(xì)胞被扣押在組織內(nèi)活化釋放，引起全身性炎癥損傷。據(jù)上分析，本實(shí)驗(yàn)I/R組第一時(shí)相的血壓下降，可能由I/R肢體產(chǎn)生釋放的ROS及炎癥介質(zhì)引發(fā);血壓下降引起外周阻力血管反射性收縮，使血壓得以短暫企穩(wěn)，這可能是第二時(shí)相的成因，是機(jī)體的代償反應(yīng)，該時(shí)相與休克Ⅰ期相當(dāng);當(dāng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致血液流變學(xué)機(jī)能紊亂，進(jìn)而出現(xiàn)微循環(huán)障礙時(shí)，便進(jìn)入了第三時(shí)相，該時(shí)相與休克Ⅱ期相當(dāng);在大范圍的微循環(huán)障礙和DIC發(fā)生后，便呈現(xiàn)出第四時(shí)相的持續(xù)低血壓狀態(tài)，第四時(shí)相與休克Ⅲ期相當(dāng)。

目前，臨床救治肢體嚴(yán)重?cái)D壓傷的措施主要有肢體切開(kāi)減壓和腎臟透析。前者是為了減輕再灌注引發(fā)的肢體水腫，后者是為了防治肢體I/R引發(fā)的腎功能障礙。更為嚴(yán)重的傷者，必要時(shí)要實(shí)施截肢手術(shù)。這些救治措施仍限于對(duì)癥處理，如何從整體水平防治肢體重度擠壓傷、阻止休克的發(fā)生，仍是一個(gè)亟待解決的難題。如上文分析，I/R損傷是有多細(xì)胞參與、多途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的全身性損傷。在治療時(shí)，針對(duì)單一靶位進(jìn)行干預(yù)的任何藥物，都難以取得理想的效果。CO是氣體信使分子，在組織內(nèi)以彌散方式傳遞，能經(jīng)不同信號(hào)途徑對(duì)不同的效應(yīng)細(xì)胞同時(shí)發(fā)揮調(diào)控作用。CO具有血管活性效應(yīng)，對(duì)微循環(huán)障礙有改善作用，CO可抑制內(nèi)皮細(xì)胞、PMN的活化，下調(diào)細(xì)胞間粘附分子(如ICAM-1)的表達(dá)，從而阻斷中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，減少PMN扣押，CO能抑制溶酶體的釋放及超氧化物的產(chǎn)生，阻斷炎癥介質(zhì)的形成過(guò)程[3-7]。在肢體I/R的條件下，內(nèi)源性CO的誘導(dǎo)酶表達(dá)上調(diào)，抑制該酶的活性則加重機(jī)體的損傷[8，9]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，使肢體I/R大鼠吸入CO后，其血壓下降的速率和幅度明顯降低，10d生存率顯著提高，受傷肢體的W/D值及血清LDH、CK活性顯著下降，病理學(xué)指標(biāo)明顯改善。該結(jié)果表明，在肢體I/R的病理狀態(tài)下，及早給予適量外源性CO可逆轉(zhuǎn)血壓的下降，有效防止休克的發(fā)生，減輕肢體的損傷。其作用機(jī)制，可從前文述及的CO的生物效應(yīng)及作用機(jī)制得到解釋。

本研究結(jié)果提示，吸入CO的辦法可能是防治肢體嚴(yán)重I/R損傷的一條重要途徑。在地震、塌方等災(zāi)害的救治中，使肢體擠壓傷的傷員及早吸入適量的CO，可對(duì)抗休克的發(fā)生，減輕肢體的損傷，且成本低廉、簡(jiǎn)便易行。值得進(jìn)一步探討的問(wèn)題是，吸入CO防治肢體嚴(yán)重I/R損傷還有哪些適應(yīng)癥和禁忌癥。

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