田云梅，聶鴻靖，劉嘉瀛，張延坤，張東祥，汪 海

(軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所軍事環(huán)境醫(yī)學研究中心，天津 300050)

我國高原地域遼闊，其中海拔3000m以上的高原主要分布在西部和西南部地區(qū)，約占全國總面積的1/4以上。人體快速進入3000m以上高原會因缺氧發(fā)生以呼吸、消化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主的急性高原反應，嚴重者會發(fā)展為高原肺水腫(high altitude pulmonary edema，HAPE)和高原腦水腫(high altitude cerebral edema，HACE)[1]，長時間低氧暴露會引發(fā)高原心臟病和高原紅細胞增多癥(high altitude polycythemia，HAPC)等慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)[2]。研究表明高原低氧導致機體免疫功能異常[3]，而這些功能異常可能與多種高原病的發(fā)生發(fā)展密切相關。這將嚴重影響高原進駐者的身體健康和高原作業(yè)效率，甚至危及生命，是亟待需要解決的問題。

低氧是一種應激刺激原，機體在刺激原的作用下，可以激發(fā)免疫細胞活化、分化和效應(免疫應答)。在免疫反應過程中，T淋巴細胞的活化依賴兩個信號，即來自抗原與T細胞受體結合的第一信號和由抗原呈遞細胞上的共刺激分子與T細胞表面的相應受體結合而產(chǎn)生的共刺激信號(第二信號)，T淋巴細胞表面共刺激分子提供的第二信號的缺乏，將會使 T細胞進入克隆無能狀態(tài)或發(fā)生凋亡[4]。CD28是T細胞上表達的具有重要功能的共刺激分子，對T細胞的活化起正向協(xié)同作用，可促進T細胞增殖、活化、IL-2分泌及抗凋亡因子Bcl-2的表達。目前尚缺乏有關高原低氧環(huán)境下CD28在機體淋巴細胞上表達變化的相關研究報道，因此本研究觀察了低氧暴露后大鼠外周血T淋巴細胞亞群及其活化共刺激分子的變化，為進一步揭示高原病的發(fā)病機制及其研究防治措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性Wistar大鼠，體重160～180g，隨機分為常氧對照組和低氧暴露組，每組10只，實驗動物由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供(合格證號:SCXK-(軍)2007-004)。

1.2 主要試劑及儀器

Anti-rat CD3-FITC、anti-rat CD4-PE-cy5、anti-rat CD8-Percp、anti-rat CD28-PE、溶血素及上樣管均購自BD公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。BD FACS Calibur流式細胞儀為BD公司產(chǎn)品，LDZ5-2型低速自動平衡離心機為北京醫(yī)用離心機廠產(chǎn)品。

1.3 急性低氧暴露條件及取材

大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，對照組動物在常氧環(huán)境中飼養(yǎng)，低氧暴露組置低壓艙內進行減壓低氧暴露:以10m/s速度上升至5000m停留5 min，以同樣速度上升至7000m停留3 min，再以同樣速度上升至8000m。模擬海拔8000m低氧暴露8 h后，以20m/s的速度降至海平面高度，第2天以同樣的方式進行低氧暴露，持續(xù)10d，分別于低氧暴露前及低氧暴露后8 h、3 d、6 d和10d采血，測定大鼠外周血T淋巴細胞亞群。

1.4 外周血T淋巴細胞亞群測定

1.4.1 樣品管制備 自大鼠后眼眶靜脈叢采血200μl，肝素抗凝 ，分別制備陰性對照管，CD3+、CD4+、CD8+、CD28+單陽性對照管和樣品管(表1)，混勻后避光放置15 min。各管加2 ml溶血素，用渦旋震蕩器充分混勻，使液體變透明，再避光放置9 min。500×g離心5 min，棄上清，加 2 ml PBS洗兩次，后加700μl PBS重新懸浮，流式細胞儀測定各樣品管T淋巴細胞亞群。

Tab.1 Preparation method of control tubes and sample tubes(μl)

1.4.2 流式細胞儀測定 打開cellquest軟件，選擇散點圖，X軸為FSC，Y軸為SSC。打開獲取條件窗口，調出獲取條件 Detectors/Voltage，Threshold和Compensation。設定獲取細胞數(shù)為10000，用陰性對照管調節(jié)細胞群，使細胞合理分布，選定淋巴細胞設門G1=R1，F(xiàn)SC＞120(圖 1A)。選擇散點圖，X 軸為CD3，Y軸為SSC，用CD3單陽性管設定CD3陽性細胞，設門G2=R2(圖1B)。再作三個散點圖:設定X軸為 CD3、Y 軸為 CD28、G1=R1(圖 1C);設定X 軸為CD3、Y 軸為 CD4或 CD8、G1=R1(圖 1D-E);設定X 軸為CD4或CD8、Y 軸為CD28、G2=R2(圖1F-G)。用陰性對照管調節(jié)FL1、FL2、FL3電壓，使細胞群位于圖的左下角，十字設定陰性、陽性細胞界限。用CD3單陽性管，對照圖1C調節(jié)FL2-FL1%熒光補償;用CD4或CD8單陽性對照管，對照圖1F/G調節(jié)FL2-FL3%熒光補償;用CD28單陽性管，對照圖1 C和F/G，分別調節(jié)FL1-FL2%和FL3-FL2%熒光補償。先獲取陰性對照管細胞，然后依次上樣，測定各樣品管。

Fig.1 Schematic diagram of setting the parameter of flow cytometer

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 低氧暴露對大鼠體重的影響

模擬海拔8000m低氧暴露8 h后，低氧組大鼠體重(173.4±7.4)g較常氧對照組(183.8±6.0)g顯著降低(P＜0.05);模擬海拔8000m低氧暴露3 d后，低氧組大鼠體重進一步降低(P＜0.01，167.7±7.5 vs 196.0±7.7)。隨著低氧暴露時間的延長，低氧組大鼠體重增長率顯著低于常氧對照組(P＜0.01)。

2.2 低氧暴露對大鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響

模擬海拔8000m低氧暴露8 h后，大鼠外周血CD3+、CD8+細胞數(shù)均顯著降低 (P＜0.01，表2)，CD4/CD8顯著增加(P＜0.05);低氧暴露6 d后，CD4+細胞數(shù)也顯著降低(P＜0.01)。說明模擬海拔8000m低氧暴露早期，大鼠細胞免疫功能受到明顯抑制。

Tab.2 Effect of hypoxia on peripheral blood T lymphocyte subsets in rats(，n=10)

Tab.2 Effect of hypoxia on peripheral blood T lymphocyte subsets in rats(，n=10)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs before hypoxia;#P＜0.05 vs hypoxia for 8 h;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs hypoxia for 3 d;▲ ▲P＜0.01 vs hypoxia for 6 d

Hypoxic time CD3+(%) CD4+(%) CD8+(%) CD4/CD8 Before hypoxia 66.66±4.46 44.77±5.00 21.27±3.31 2.15±0.36 Hypoxia for 8 h 59.04±7.14** 40.28±6.22 16.30±1.54** 2.48±0.36*Hypoxia for 3 d 57.95±5.78** 38.86±5.76 15.91±3.12** 2.53±0.64 Hypoxia for 6 d 55.92±5.97** 35.53±3.33**# 18.35±3.66* 1.99±0.34#△Hypoxia for 10d 51.36±7.68**△▲▲ 33.89±5.55**#△ 17.05±3.86* 2.03±0.34#△△

2.3 低氧暴露對大鼠外周血T淋巴細胞活化共刺激分子的影響

模擬海拔8000m低氧暴露8 h后，大鼠外周血CD8+CD28+、CD8+CD28-細胞數(shù)均顯著降低;低氧暴露3 d后，CD4+CD28+細胞數(shù)顯著降低(P＜0.01，圖2A)，CD4+CD28-細胞數(shù)顯著增加(P＜0.01，圖2B)，CD8+CD28+、CD8+CD28-細胞數(shù)有所恢復;低氧暴露6 d后，大鼠外周血CD8+CD28+細胞數(shù)顯著增加(P＜0.01，圖2A)。說明模擬海拔8000m低氧暴露8 h和3 d后，大鼠外周血 CD8+、CD4+T淋巴細胞活化水平均顯著下降，隨著低氧暴露時間的延長，CD8+T淋巴細胞活化水平由降低變?yōu)樵黾印?/p>

3 討論

在淋巴細胞中占相當比例的T淋巴細胞(CD3+)，根據(jù)其表面標志和功能特征，可分為CD4+和CD8+兩個細胞亞群。CD4+細胞為輔助性T細胞，是免疫反應的中心細胞。CD4+T細胞在胸腺主要產(chǎn)生Th1型細胞和Th2型細胞，其中Th1型細胞可以產(chǎn)生IL-2，TNF-α，INF-γ等細胞因子，它們可以促進細胞介導的免疫反應;Th2型細胞可以產(chǎn)生如IL-4，IL-10等細胞因子，它們可以刺激B細胞產(chǎn)生抗體。CD8+細胞為細胞毒性T細胞，是免疫反應的效應細胞。研究表明模擬海拔8000m低氧暴露10d期間，大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+細胞數(shù)均有不同程度的下降，CD3+、CD4+細胞數(shù)下降趨勢與小鼠試驗基本相同[5]。實驗結果提示模擬海拔8000m低氧暴露10d期間，大鼠細胞免疫功能紊亂。

Fig.2 Effect of hypoxia on peripheral blood CD28+and CD28-T lymphocyte subsets in rats(ˉx ± s，n=10)

T細胞活化并發(fā)揮效應作用需要兩個信號:一是抗原特異性刺激信號，另一個是T淋巴細胞協(xié)同刺激因子所提供的第二信號。T細胞表面有許多重要的共刺激分子，參與T細胞的活化、增殖及發(fā)揮效應功能，其中CD28是特異性細胞免疫應答所必需的信號。依據(jù)CD28的表達與否，可將T細胞分為CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD4+CD28+、CD4+CD28-四個細胞亞群。

CD8+CD28+T細胞是主要組織相容性復合體-1類限制性細胞毒前體細胞，具有MHC-1類限制細胞毒活性，在CD4細胞分泌的細胞因子作用下，分化為效應性殺傷T細胞[6];CD4+CD28+T細胞是代表大多數(shù)輔助性T細胞。本實驗從T細胞活化共刺激分子角度研究低氧暴露對T淋巴細胞活化的影響，結果表明模擬海拔8000m低氧暴露8 h后，CD8+CD28+T細胞顯著下降，低氧暴露 3 d后，CD4+CD28+T細胞也顯著下降，提示低氧暴露早期T淋巴細胞活化水平降低。

CD8+CD28-T細胞具有短的端粒，分化能力比CD8+CD28+T細胞低，是一種終末細胞，是由于抗原的慢性刺激而由CD8+CD28+細胞分化而來，能直接作用于輔助性T細胞，可以通過抑制抗原提呈細胞CD40信號通路從而抑制CD4+T細胞的增殖。體外實驗證明CD8+CD28-T細胞可以抑制IFN-γ的產(chǎn)生，從而對炎癥疾病具有保護作用[7]。Komocsi等[8]報道，使用 anti-CD3 MAb刺激Wagener's肉芽腫患者外周血及肉芽腫內的CD4+CD28-T細胞，并體外克隆擴增24h后測定細胞因子水平，發(fā)現(xiàn)CD4+CD28-T細胞大量分泌 IFN-γ及TNF-α，與此同時在CD28分子缺乏時保持對IL-12的敏感性，擴大Th1細胞的效應。本次實驗研究表明模擬海拔8000m低氧暴露 8 h后，大鼠外周血CD8+CD28-細胞水平顯著性下降;低氧暴露3 d后，大鼠外周血CD4+CD28-T細胞數(shù)顯著增加。

低氧暴露后，大鼠外周血T淋巴細胞亞群的這個變化過程可能有兩種解釋:一是高原低氧暴露后，促腎上腺皮質激素、環(huán)腺苷酸和糖皮質激素顯著增加[9]，從而免疫系統(tǒng)受到抑制，機體可能通過減少對免疫反應的負調節(jié)作用和增加Th1型細胞因子的分泌來實現(xiàn)免疫反應的穩(wěn)態(tài)，在此過程中可能會導致Th1型和Th2型細胞因子分泌失衡。二是在高原早期肺水腫患者的肺泡灌洗液中前炎癥因子顯著增加[10]，大鼠外周血T淋巴細胞的變化過程可能與低氧暴露后前炎癥因子增加有關。

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