楊云春，周 賢，伍佳麗，姜 鮮，周述芝，王曉斌

(瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 瀘州 646000)

大腦皮質神經元參與了意識的形成和維持意識清醒，而皮質功能是通過各種離子通道完成，其中鈉離子通道開放引起的去極化內向電流是其產生動作電位的關鍵。咪達唑侖是目前臨床上廣泛應用的鎮(zhèn)靜催眠藥，其作用位點與神經元電壓門控型鈉離子通道有關[1];而芬太尼為阿片類鎮(zhèn)痛藥，但鎮(zhèn)靜效果欠佳。兩者臨床上常小劑量復合應用于局部麻醉強化用藥，但其聯(lián)合應用后發(fā)生協(xié)同效應的原因目前還不完全清楚，亦未見相關文獻報道。本實驗選擇大腦皮質神經元作為研究對象，觀察鎮(zhèn)靜劑量咪達唑侖和芬太尼對大腦皮質神經元上的鈉離子通道電流的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

選SD新生大鼠(1～3 d)，雌雄不拘，清潔級，由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供;膜片鉗放大器(AXOPA/PFTCH200B Axon Instruments USA)，微管電極拉制器(PC-10NARISHIGE JAPA/PFN)，倒置相差顯微鏡(AXIOVERT135 ZEISS GERMANY)，A/D、D/A 轉換器(DIGIDATA-1200Axon Instruments USA)，二氧化碳孵箱(1815Tc SHEL-LAB U.S.A)，數據處理系統(tǒng)pClamp軟件(10.1)(Axon Instruments);咪達唑侖(2 mg/2 ml)、芬太尼(0.01μg/2 ml，湖北宜昌人福藥業(yè)有限公司)，TTX(河豚毒素，大連瑞芳化學公司)。

1.2 實驗方法與分組

1.2.1 細胞培養(yǎng) 選用1～3天SD新生大鼠大腦皮層神經元行原代培養(yǎng)。取培養(yǎng)第4～9天的細胞用于全細胞膜片鉗記錄。

1.2.2 膜片鉗實驗記錄 應用全細胞膜片鉗法進行記錄，選用形態(tài)呈錐體形，有一較長軸突和1～3個樹突的細胞進行記錄，用經100%O2飽和的細胞外液做持續(xù)灌流。兩步法拉制玻璃微電極，內充電內液后，阻抗2～5 MΩ。采樣頻率20kHz，低通濾波1 kHz，在電極尖端與細胞膜接觸形成巨阻封接(＞1 GΩ)后，吸破尖端膜片形成全細胞狀態(tài)，補償電容和串聯(lián)阻抗后，進行下一步電流記錄。數據采集、貯存和分析實驗中全細胞電流信號由計算機采集，電刺激脈沖的輸出以及電信號的采入均通過計算機程序pClamp10.1及digidata1200轉換器接口來完成。全細胞模型記錄鈉通道電流(INa)的鉗制電壓為-90mV，從-80mV開始以10mV遞增的去極化方波刺激，時間持續(xù)50ms，直到30mV ，記錄電流變化，繪制電流電壓曲線。

1.2.3 實驗分組 空白組:用不含藥物的細胞外液灌流記錄最大鈉離子通道電流;F5組:用含5μg/L芬太尼的細胞外液灌流記錄最大鈉離子通道電流;F5+M200組:用含200μg/L咪達唑侖以及5μg/L芬太尼的細胞外液灌流記錄最大鈉離子通道電流。各組總共記錄5個細胞。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數據采用pClamp10.1軟件(Axon Instruments)進行分析處理。采用同一膜片實驗前后自身對照，數據以均數±標準差()表示，顯著性檢驗采用配對 t檢驗，t檢驗采用SPSS 14.0軟件完成。

2 結果

2.1 培養(yǎng)的大鼠皮質神經元上鈉離子通道的電生理特性

采用全細胞電壓鉗制脈沖刺激模式記錄大鼠皮質神經元細胞膜上鈉離子通道電流(INa)，保持電位(holding potential，hp)為-90mV，測試電壓(test potential，TP)為-80mV 到+30mV，脈沖階躍步長為10mV，共12個階躍，鉗制時間(Clamp time，ct)為50ms，引出大鼠皮質神經元細胞膜上的 INa.該電流為快速激活的內向電流，持續(xù)時間約 5 ms，能被1μmol/L的TTX阻斷，而TTX為鈉離子電流的特異性阻斷劑，同時在電極內液中不含鈣離子且含鈣離子螯合劑EGTA，細胞外液中加入了鈣離子特異性阻斷劑CdCl2，因此可以證實該電流為對TTX敏感的鈉電流。

2.2 咪達唑侖復合芬太尼對鈉離子通道電流的影響

2.2.1 各個細胞用藥前后最大電流變化 用藥前細胞平均最大電流為(-267.00±115.36)pA/pF，而用藥后，F(xiàn)5組平均最大電流為(-231.90±97.16)pA/pF，與空白組比較，有顯著性差異(n=5，P＜0.05);200μg/L咪達唑侖合用5μg/L芬太尼(F5+M200)灌流后平均最大電流為(-213.98±91.68)pA/pF，與F5組比較，也存在顯著性差異(n=5，表1)。

Tab.1 Changes of density of sodium peak currents in cortical neurons

2.2.2 同一個細胞在不同膜電壓刺激下各組鈉離子通道電流 圖1表示鉗制電位為-90mV時，自-80mV起，刺激電壓每次增加10mV，直到+30mV;在同一個細胞上所記錄到的電流曲線圖，可見電流幅度的變化。A為對照組，B為F5組，C為F5+M200組，D為用細胞外液灌流后電流恢復情況。

Fig.1 Changes of voltage-gated sodium channels currents of cortical neuron in different voltages

2.2.3 芬太尼、芬太尼復合咪達唑侖對細胞電流-電壓曲線的影響 圖2表示以不同電壓下的最大電流值為縱坐標，刺激電壓為橫坐標的電流-電壓曲線圖，從電流電壓曲線圖可以看出，芬太尼合用咪達唑侖后，對鈉離子通道的電流抑制程度較單用芬太尼時明顯增強。

Fig.2 Changes of sodium channels currents-voltage of cortical neuron in different groups

3 討論

隨著分子生物學和神經生理學的迅速發(fā)展，人們對全麻藥的作用機理認識不斷提高，目前認為全麻藥主要作用于膜蛋白而非膜脂質，隨著膜片鉗技術的發(fā)展，越來越多的證據表明神經細胞膜上的離子通道是全麻藥的作用靶位[1～3]。由于電壓門控型鈉離子通道是可興奮性細胞產生動作電位和傳導神經沖動的關鍵部位和決定因素，對神經元的聯(lián)系和整合功能起著極其重要的作用，因此被認為是全麻藥分子作用靶位。皮質神經元是大腦中的最重要部分，參與意識的形成和維持意識清醒，是記憶的重要編碼部位。而皮質的功能通過各種離子通道完成，其中鈉離子通道開放引起的去極化內向電流是興奮性細胞產生動作電位的關鍵。咪達唑侖是目前臨床上廣泛應用的鎮(zhèn)靜藥，主要用于全麻的誘導以及局部麻醉后的鎮(zhèn)靜，具有起效快，作用時間短，有較優(yōu)良的順行性遺忘作用，但是缺乏鎮(zhèn)痛作用;而芬太尼為阿片類鎮(zhèn)痛藥，但是鎮(zhèn)靜效果欠佳。因此兩者作用互補，應用在鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等方面具有協(xié)同作用[4]，從而減少單一藥物的用量，降低不良反應的發(fā)生，到目前為止，文獻證實咪達唑侖復合芬太尼在鎮(zhèn)靜效能方面是比較理想的選擇。但就其聯(lián)合應用后發(fā)生協(xié)同效應的原因目前還不完全清楚，亦未見相關文獻報道。

因此本實驗選擇大腦皮質神經元作為研究對象，觀察鎮(zhèn)靜劑量咪達唑侖 200μg/L和芬太尼5μg/L(在定量藥理學中，不同種屬間藥物量的換算公式DB=DA*(WA/WB)1/3*RB/RA，DB為要求得的B種動物的公斤體重劑量，DA是已知A種動物的公斤體重劑量;WA、WB為已知動物體質量，RB、RA是體型系數。大鼠的體型系數是0.09，人的體型系數是0.1)對大腦皮質神經元上的鈉離子通道電流的影響對大腦皮質神經元上的鈉離子通道電流的影響，探討兩種藥物聯(lián)合應用后藥理學作用增強的分子作用機制。在本實驗之前，我們通過預實驗發(fā)現(xiàn)，咪達唑侖對大鼠皮質神經元鈉離子通道電流的影響輕微，亦未表現(xiàn)出濃度依賴性抑制，因此在本實驗過程中，未再單獨觀察咪達唑侖對鈉離子通道電流的影響。結果發(fā)現(xiàn)小劑量芬太尼聯(lián)合咪達唑侖后對鈉離子通道電流的抑制明顯大于對照組和單用小劑量芬太尼組，其P值均小于0.05，提示兩藥合用后對大腦皮質神經元鈉離子通道電流抑制作用增強，這可能是兩種藥物臨床合用后鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用增強的機制之一。

[1]Zhou X，Dong X W，Priestley T.The neuroleptic drug，fluphenazine，blocks neuronal voltage-gated sodium channels[J].Brain Res，2006，1106(1):72-81.

[2]Haeseler G，F(xiàn)oadi N，Ahrens J，et al.Tramadol，fentanyl and sufentanil but not morphine block voltage-operated sodium channels[J].pain，2006，126(1-3):234-244.

[3]Martella G，De Persis C，Bonsi P，et al.Inhibition of persistent sodium current fraction and voltage-gated L-type calcium current by propofol in cortical neurons:implications for its antiepileptic activity[J].Epilepsia，2005，46(5):624-635.

[4]Baris S，Karakaya D，Aykent R，et al.Comparison of midazolam with or without fentanyl for conscious sedation and hemodynamics in coronary angiography[J].Can J Cardiol，2001，17(3):277-281.

[5]Richman P S，Baram D，Varela M，et al.Sedation during mechanical ventilation:a trial of benzodiazepine and opiate incombination[J].Crit Care Med，2006，34(5):1395-1401.