王 瑩，李文媛，楊春壯，馮克儉

（牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江牡丹江 157011）

內(nèi)皮素（endothelin，ET）是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的活性肽。ET家族中與腫瘤關(guān)系最密切的是血管ET-1［1］，不僅產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細(xì)胞，也可由人體內(nèi)多種腫瘤細(xì)胞所分泌，是近年來腫瘤防治研究的熱點(diǎn)。有研究表明，在口腔癌、卵巢癌、甲狀腺癌、皮膚癌、肺癌等［2-6］多種惡性腫瘤中可見ET-1有高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有顯著關(guān)系，但ET-1在喉癌中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，該研究對(duì)喉癌中ET-1表達(dá)與淋巴管密度（lymphatic vessel density，LVD）、微血管密度（microvessel density，MVD）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和喉癌預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行研究，旨在為喉癌的診治研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料 取中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科2004年1月至2009年3月首次手術(shù)治療的原發(fā)喉癌患者，共計(jì)45例。男43例，女2例，患者年齡41～86 歲，中位年齡63.5歲。聲門上癌17例，聲門癌23例，聲門下癌 5例。按1997年UICC的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期31例。有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例，淋巴管浸潤(rùn)者8例，所有病例均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，術(shù)前未接受化療、放療及其他抗癌治療。生存資料通過信訪或電話獲得，生存期開始時(shí)間自手術(shù)日期始，至2009年6月1日止，其中2例失訪。生存期計(jì)算以月為單位，未滿整月以實(shí)際生存天數(shù)計(jì)算。隨訪期限為3～71個(gè)月，中位數(shù)為31個(gè)月。死亡病例均由復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移引起。同時(shí)收集10例正常喉良性病變用于對(duì)照。

1.2 主要試劑 二甲胂酸鈉，腺苷-5'-磷酸鈉，萘酚AS-MX磷酸鈉，左旋咪唑，固藍(lán)BB鹽，二甲基甲酰胺（DMF）均購自美國 SIGMA公司。兔抗人 ET-1抗體、兔抗人CD34抗體、免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購于北京中山生物試劑公司橋生物公司，抗β-actin抗體購于Santa Cruz公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，0.5%過氧化氫孵育10 min;PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15 min后，滴加稀釋后的一抗ET-1（1∶100）、CD34（1∶100）。4℃過夜。滴加生物素標(biāo)記體，30 min，37℃。滴加過氧化物-鏈霉素卵白素37℃，30 min。3，3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色液顯色，蘇木精復(fù)染。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。鏡下觀察并攝片。陽性率的定量分析:隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野按陽性細(xì)胞比例及著色程度記分，行半定量分析。無著色細(xì)胞記為0分;著色細(xì)胞比例≤1/3記為1分;1/3＜著色細(xì)胞比例≤2/3記為2分;著色細(xì)胞比例＞2/3記為3分。淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分;然后根據(jù)二者乘積判斷陽性結(jié)果:二項(xiàng)乘積≤3分記為（－）;＞3分記為（+）。MVD定量分析:采用 Weidner等［7］制訂的方法確定微血管密度，先在低倍鏡下選擇淋巴管最豐富區(qū)域，在高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野微血管數(shù)取其平均值作為微血管密度。

1.4 酶組化染色方法 冰凍切片吹干后，分兩組:A組作5'-Nase染色，即將切片置入5'-Nase標(biāo)準(zhǔn)液（反應(yīng)液）內(nèi)，37℃孵育40 min。水洗后入1%硫化銨內(nèi)2 min后封片，光鏡下觀察結(jié)果。反應(yīng)液內(nèi)含有0.2 mol/L的 Tris-順丁稀二酸緩沖液（pH7.2）20 mL，腺苷5'-磷酸鈉（5'-AMP）25 mg，硫酸鎂123 mg，硝酸鉛60 mg，蔗糖3 g，蒸餾水22 mL。B組作對(duì)照試驗(yàn)，將孵育液中的底物去除，即再反應(yīng)液內(nèi)不加腺苷5'-磷酸鈉，其余步驟同A組。LVD定量分析:參照Kaiserling［8］計(jì)數(shù)方法，先在低倍鏡下選擇淋巴管最豐富區(qū)域，在高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野淋巴管數(shù)，取其均值作為該切片淋巴管數(shù)。

1.5 Western blot檢測(cè) 檢測(cè)ET-1提取蛋白后采用BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜;封閉緩沖液封閉后，加入一抗（anti-ET-1，1∶100稀釋）4℃孵育過夜，二抗（1∶2000稀釋）孵育2 h，TBS洗凈后經(jīng)顯色液顯示15 min，掃描后經(jīng)ImageJ圖像分析軟件對(duì)印跡區(qū)進(jìn)行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)，兩組間LVD、MVD比較采用t檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線差異性采用 Log-rank法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌組織中ET-1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 ET-1陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒（圖1A），陰性細(xì)胞胞質(zhì)不著色。5'-Nase特異性地表達(dá)在喉癌組織中毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，標(biāo)記毛細(xì)淋巴管呈棕色管腔（圖1B），血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞未見表達(dá)。CD34染色后微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，標(biāo)記微血管呈棕色管腔（圖1C）。ET-1在喉癌組織蛋白表達(dá)顯著高于正常組織（χ2=7.084，P＜0.05）。在各種臨床病理因素中，ET-1蛋白表達(dá)與淋巴管密度（t=38.633，P=0.042）、微血管密度（t=229.614，P=0.05）、TNM 病理分期（χ2=7.106，P=0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=7.679，P=0.05）和淋巴管浸潤(rùn)（χ2=7.784，P=0.05）密切相關(guān)，但與年齡、性別、腫瘤部位、組織學(xué)分級(jí)無關(guān)（χ2=3.375、2.616、2.492、2.510，P＞0.05）（表1，2）。

圖1 A 喉癌組織中ET-1陽性表達(dá)（SP×200） 圖1B 喉癌組織中淋巴管（5'-Nase×200） 圖1C 喉癌組織中微血管（SP×200）

2.2 Western-blot檢測(cè)喉癌組織中ET-1的表達(dá)Western-bolt檢測(cè)6例喉癌組織和6例喉良性病變組織中ET-1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示喉癌組織中ET-1蛋白的相對(duì)表達(dá)較正常喉組織顯著增高（t=28.838，P＜0.05）（圖 2）。

2.3 ET-1陽性表達(dá)與生存率的關(guān)系 按ET-1表達(dá)陰性和陽性將喉癌患者分為兩組［（－）為陰性，（+）為陽性］，Kaplan-Meier生存分析繪出喉癌患者整體生存曲線，ET-1陽性表達(dá)平均生存時(shí)間為37個(gè)月，陰性表達(dá)組平均生存時(shí)間為55個(gè)月，Log-rank檢驗(yàn)表明兩組生存率無顯著性差異（χ2=1.148，P＞0.05）（圖3）。

圖2 ET-1蛋白在喉癌與配對(duì)良性病變組織中的表達(dá)

圖3 喉癌患者整體生存曲線

表1 喉癌組織中ET-1的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

表2 喉癌組織中ET-1的表達(dá)與LVD、MVD的關(guān)系±s）

表2 喉癌組織中ET-1的表達(dá)與LVD、MVD的關(guān)系±s）

注:*與ET-1陰性組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) ET-1（+）（n=25） （－）（n=20）LVD 45 12.82 ±5.79 5.77 ±2.83 MVD 45 24.82 ±8.54 18.91 ±7.42 t 38.633 29.614 P 0.042* 0.009*

3 討論

目前的研究發(fā)現(xiàn)，ET-1在多種人類惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，引起了國內(nèi)外學(xué)者的重視，有研究表明其促腫瘤的作用機(jī)制可能包括以下幾個(gè)方面:①通過細(xì)胞內(nèi)一系列信息轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起細(xì)胞有絲分裂和增殖［9］。②促進(jìn)新生腫瘤血管形成［10］。③抑制腫瘤細(xì)胞凋亡［11］。④促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲［12］。但ET-1是否在喉癌中發(fā)揮相同作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)喉癌組織中ET-1蛋白表達(dá)顯著增高，與TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理因素密切相關(guān)，說明ET-1能夠在喉癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。楊小燕等［13］認(rèn)為腫瘤組織分化程度越高，ET-1表達(dá)越低，但該研究不支持此觀點(diǎn)，該研究的結(jié)果顯示，喉癌組織中ET-1表達(dá)與分化程度無關(guān)。

有研究證實(shí)，ET-1在卵巢癌、甲狀腺癌及肺癌中具有促血管生成作用［3，4，6］。該研究發(fā)現(xiàn)喉癌組織中ET-1表達(dá)與MVD密切相關(guān)，說明ET-1能夠促進(jìn)喉癌組織中血管生成，從而增加喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。ET-1是否能夠促進(jìn)喉癌淋巴管生成，目前未見相關(guān)報(bào)道。本研究中喉癌組織中ET-1表達(dá)與LVD、淋巴管浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示ET-1不僅可以促進(jìn)喉癌血管生成，還可以促進(jìn)喉癌淋巴管生成，加速喉癌細(xì)胞淋巴管浸潤(rùn)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能與ET-1表達(dá)增高能夠上調(diào)淋巴管生長(zhǎng)因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)淋巴管生成有關(guān)［14］。

目前ET-1對(duì)腫瘤預(yù)后的相關(guān)報(bào)道尚不多見，且爭(zhēng)議較多。如Arun等［15］認(rèn)為 ET-1、年齡與組織學(xué)分期可以影響大腸癌的預(yù)后，而Peeters等［16］發(fā)現(xiàn)，ET-1表達(dá)與大腸癌預(yù)后無關(guān)。Wulfing等［17］認(rèn)為，ET-1的高表達(dá)與乳腺癌生存時(shí)間相關(guān)，但Yamashita等［18］發(fā)現(xiàn)，ET-1對(duì)乳腺癌生存時(shí)間并無影響。本試驗(yàn)通過Kaplan-Meier生存分析繪出45例喉癌患者整體生存曲線，結(jié)果表明ET-1陽性表達(dá)與生存曲線不相關(guān)。然而，因?yàn)榇搜芯渴轻槍?duì)一組有限喉癌患者數(shù)量的回顧性研究，所以ET-1與喉癌預(yù)后的關(guān)系仍有待于進(jìn)一步大樣本前瞻性的臨床研究。

綜上所述，ET-1不僅可以促進(jìn)喉癌血管生成，也可以促進(jìn)喉癌淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。ET-1在腫瘤血管生成和淋巴管生成中的作用及基于此的腫瘤抗血管和淋巴管生成的靶向治療將為人們開辟一條新的途徑。

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