陳瑤，肖芳，馮琳珊，肖鵬，董慧，劉祖祥，鄒啟發(fā)（.云南省第一人民醫(yī)院藥劑科，昆明市 650000；.云南白藥集團(tuán)股份有限公司技術(shù)質(zhì)量部，昆明市 650000）

慢支咳喘膏是云南省第一人民醫(yī)院臨床使用40余年的協(xié)定處方，由麻黃、黃芪、甘草、南沙參等藥材組成，具有益氣補(bǔ)肺、止咳化痰、平喘的功效，主要用于治療慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病等所致的久咳喘癥，效果顯著。本試驗(yàn)對(duì)制劑中麻黃、黃芪、甘草3味藥材進(jìn)行薄層色譜（TLC）鑒別，同時(shí)用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定了制劑中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽鹽酸麻黃堿的含量，旨在建立慢支咳喘膏質(zhì)量控制的有效方法。

1 儀器與試藥

Agilent1100型HPLC儀，包括G1315B紫外檢測(cè)器、G1316A柱溫箱、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1311A四元梯度泵、G1379A真空脫氣機(jī)、Agilent ChemStation工作站（美國Agilent公司）；薄層層析用硅膠G板（青島海洋化工有限公司，規(guī)格：100 mm×100 mm）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、黃芪甲苷、甘草酸銨對(duì)照品和甘草對(duì)照藥材（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為0090-9801、1237-200103、0781-200311、100731-200615、120904-2004101）；黃芪、麻黃、甘草飲片（批號(hào)分別為100401、100601、100401）、樣品（批號(hào)：20100122、2010051820101025）及相應(yīng)陰性樣品均由昆明道地中藥廠提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（97∶3）；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿色譜峰計(jì)算應(yīng)＞6000。

2.2 定性鑒別

2.2.1 麻黃的TLC鑒別 取本品20 g，加10%氨水試液30 mL，充分混勻，加氯仿提取2次，每次40 mL，合并氯仿液，蒸干。殘?jiān)?0%鹽酸1 mL溶解，作為供試品溶液；另取鹽酸麻黃堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；取缺麻黃的陰性樣品2 g，同供試品制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5～10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-氨水（20∶3.5∶0.5）溶液為展開劑，展開8 cm，取出，晾干，噴以1%茚三酮溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的紅色斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。麻黃的TLC見圖1。

2.2.2 黃芪的TLC鑒別[1]取本品15 g，加甲醇40 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，加熱使溶解，用乙醚提取3次，每次15 mL，棄去乙醚液，水層揮去乙醚，用水飽和的正丁醇提取3次，每次20 mL。合并正丁醇液，用正丁醇飽和的1%KOH溶液洗滌3次，每次15 mL，再用正丁醇飽和的水洗滌至中性，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；取缺黃芪的陰性樣品3 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5～10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水（6∶3∶0.5）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰，置紫外光（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。黃芪的TLC見圖2。

2.2.3 甘草的TLC鑒別[2]取本品10 g，加乙醚50 mL，超聲處理1 h，濾過，藥渣加甲醇40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗脫3次，每次20 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取甘草對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液；再取甘草酸銨對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取缺甘草的陰性樣品3 g，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照TLC法[2]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶1∶3）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰，置紫外光（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃綠色熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。甘草的TLC見圖3。

圖1 麻黃的TLC1～3.供試品；4.鹽酸麻黃堿對(duì)照品；5.陰性對(duì)照Fig 1 TLC of Herba Ephedrae1～3.test samples；4.ephedrinehydrochloridecontrol；5.negative control

圖2 黃芪的TLC1～3.供試品；4.黃芪甲苷對(duì)照品；5.陰性對(duì)照Fig 2 TLC of Astragalus membranaceus1～3.test samples；4.astra-galosideⅣ c ontrol；5.negative control

圖3 甘草的TLC1～3.供試品；4.甘草對(duì)照藥材；5.甘草酸銨對(duì)照品；6.陰性對(duì)照Fig 3 TLC of Radix Glycyrrhizae1～3.test samples；4.Radix Glycyrrhizae reference substance；5.ammonium glycyrrhetate control；6.negative control

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品適量，精密稱定，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液制成每1 mL含鹽酸麻黃堿10μg和每1 mL含鹽酸偽麻黃堿30μg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品10 g，精密稱定，加水10mL和濃氨試液 7 mL，用乙醚振搖提取5次（30、30、30、20、20 mL），合并乙醚液，低溫回收至干，殘?jiān)靡掖?mL溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按慢支咳喘膏的制法制備不含麻黃的提取物，照供試品溶液的處理方法制備溶液，即得。

2.3.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)和專屬性考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μL，注入色譜儀測(cè)定。結(jié)果，供試品溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處出現(xiàn)色譜峰；陰性對(duì)照無干擾。色譜見圖4。

圖4 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿Fig 4 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.ephedrine hydrochloride control；2.pseudoephedrine hydrochloride

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得麻黃堿、鹽酸麻黃堿的回歸方程分別為Y＝28.691X－3.4197（r＝0.9997）、Y＝74.026X－0.781（r＝0.9998）。結(jié)果表明，麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿進(jìn)樣量在1.3～32.5、3.4～85μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品溶液10μL，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD分別為0.98%、0.76%，n均為6，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，分別于0、1、3、6、9、12 h按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD分別為0.94%、0.78%（n均為6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品適量，共6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。結(jié)果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積RSD分別為0.68%、0.99%（n均為6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量的樣品（批號(hào)：20101025）9份，各約5 g，精密稱定，分別依次精密加入0.1 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液，使成為3個(gè)不同濃度的樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液。照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1、表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.3.10 樣品含量測(cè)定 取3批供試品溶液適量，按上述色譜條件測(cè)定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量，結(jié)果見表2。

3 討論

黃芪的TLC鑒別中，曾采用超聲法處理樣品，但黃芪甲苷斑點(diǎn)不明顯；曾將提取液上中性氧化鋁柱純化樣品，黃芪甲苷斑點(diǎn)與雜質(zhì)點(diǎn)重合，斑點(diǎn)也不明顯。本試驗(yàn)中先用乙醚去雜質(zhì)，再采用堿洗脫色；同時(shí)，由于正丁醇與水易發(fā)生乳化，所以先用正丁醇飽和堿液以加快洗脫；2005年版《中國藥典》中展開系統(tǒng)為氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）需低溫分層后使用，耗能耗時(shí)，故采用氯仿-甲醇-水（6∶3∶0.5）系統(tǒng)展開，方法簡(jiǎn)單，Rf值適中。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 2 Results of content determination of samples

甘草的TLC鑒別中，曾嘗試按2005年版《中國藥典》方法以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）為展開劑，但樣品中甘草酸銨對(duì)照品色譜相應(yīng)位置有干擾，檢視不明顯，故采用本文中展開系統(tǒng)，甘草酸銨斑點(diǎn)清晰，無干擾。

本試驗(yàn)中曾嘗試用氯仿作為提取溶劑制備供試品溶液，但乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，損失量較大。而用濃氨水將樣品調(diào)至堿性后，用乙醚萃取，回收率良好。

方中麻黃作為君藥，具有發(fā)汗平喘的功效，用于治療痹痛有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛效果[3]。鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿為麻黃中重要的化學(xué)成分，其中的鹽酸偽麻黃堿具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[4，5]。為制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究選用鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿作為檢測(cè)指標(biāo)，以HPLC法測(cè)定2種成分的含量。本試驗(yàn)中采用乙腈-0.1%磷酸溶液（97∶3）為流動(dòng)相，經(jīng)方法學(xué)考察，此方法簡(jiǎn)單，專屬性強(qiáng)、分離度好、且保留時(shí)間適宜，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及加樣回收率良好。

[1]謝虞升，李漢保，宋炳生.對(duì)1995版黃芪薄層鑒別法的探討[J].中草藥，1999，3（30）：192.

[2]國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄31、59.

[3]高嘩珩，黨力納.麻黃研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，6（20）：60.

[4]吳桂榮，王曉文.偽麻黃堿水楊酸鹽的藥用研究——鎮(zhèn)痛、抗炎及對(duì)胃黏膜的刺激的考察[J].藥學(xué)進(jìn)展，2000，24（2）：107.

[5]吳桂榮，王曉文.偽麻黃堿水楊酸鹽的藥用研究——解熱、對(duì)心率和血壓及組胺所致刺激反應(yīng)的影響[J].藥學(xué)進(jìn)展，2000，24（4）：238.