朱艷容，李媛媛，倪艷，李先榮#，王曉敏，秦霞（.山西省中醫(yī)藥研究院方劑研究所，太原市 000；.山西振東開(kāi)元制藥有限公司，長(zhǎng)治市 04608；.太原理工大學(xué)校醫(yī)院，太原市 0004）

扶正固本顆粒由黃芩、茜草、淫羊藿、何首烏等8味藥材組成，具有益氣養(yǎng)陰、涼血解毒的功效，主要為食管癌、胃癌等氣陰兩虛兼熱毒證患者放、化療時(shí)合并用藥。該制劑收載于國(guó)家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（WS-5250（B-0250）-2002），為了控制本品質(zhì)量，更好的保證臨床療效，本研究建立了黃芩、女貞子、何首烏、茜草、淫羊藿的薄層色譜（TLC）鑒別方法和淫羊藿苷的含量測(cè)定方法，并對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，以為扶正固本顆粒制訂準(zhǔn)確、可靠的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1100高效液相色譜（HPLC）儀，包括Agilent G1321A四元泵、G1322A真空在線脫氣機(jī)、tG1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315 DAD二極管陣列檢測(cè)器、安捷倫化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；UV-8型三用紫外分析儀（上海分析儀器有限公司）。

黃芩苷、齊墩果酸、大黃素、大葉茜草素、淫羊藿苷對(duì)照品和黃芩、女貞子、何首烏、淫羊藿、茜草對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110715-200514、110709-200505、110825-200607、110884-200604、110737-200415、927-9905、1075-9903、923-9901、905-9602、907-9204）；扶正固本顆粒（規(guī)格：15 g/袋；批號(hào)：091002、090401、081202）及相應(yīng)陰性樣品均由山西振東開(kāi)元制藥有限公司生產(chǎn)；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃芩的TLC鑒別 取本品15 g，研細(xì)，加甲醇20 mL，振搖30 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液；再取缺黃芩的陰性樣品3 g和對(duì)照藥材0.5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液和對(duì)照藥材溶液；另取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC[1]法試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液[2]，日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。黃芩的TLC見(jiàn)圖1。

2.1.2 女貞子的TLC鑒別 取本品10 g，研細(xì)，加乙醚40 mL，低溫回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；再取缺女貞子的陰性樣品3 g和對(duì)照藥材0.5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液和對(duì)照藥材溶液；另取齊墩果酸對(duì)照品，加乙醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC[1]法試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各15 μL，對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。女貞子的TLC見(jiàn)圖2。

2.1.3 何首烏的TLC鑒別 取本品15 g，研細(xì)，加甲醇40 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸2 mL，置水浴上加熱 30 min，冷卻[3]，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；再取缺何首烏的陰性樣品8 g和對(duì)照藥材0.4 g，同法制成陰性對(duì)照溶液和對(duì)照藥材溶液；另取大黃素對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC[1]法試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL，對(duì)照藥材溶液5 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15∶2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。何首烏的TLC見(jiàn)圖3。

圖1 黃芩的TLC1～3.供試品；4.黃芩對(duì)照藥材；5.黃芩苷對(duì)照品；6，7.陰性對(duì)照Fig 1 TLC of Scutellaria baicalensis1～3.test samples；4.Scutellariae Radix reference substance；5.baicalin control；6，7.negative control

圖2 女貞子的TLC1～3.供試品；4.女貞子對(duì)照藥材；5.齊墩果酸對(duì)照品；6.陰性對(duì)照Fig 2 TLC of Ligustrum lucidum1～3.test samples；4.Ligusti Lucidi Fructus reference substance；5.oleanolic acid control；6.negative control

2.1.4 淫羊藿的TLC鑒別[4]取本品15 g，研細(xì)，置錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲處理 15 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，溶液通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理柱（內(nèi)徑2 cm，長(zhǎng)12 cm），先用水100 mL洗脫，棄去水液，繼用50%乙醇100 mL洗脫，棄去50%乙醇洗脫液，最后用95%乙醇100 mL洗脫，收集此洗脫液于水浴蒸干，殘?jiān)?5%乙醇溶液1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取缺淫羊藿的陰性樣品3 g和對(duì)照藥材0.5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液和對(duì)照藥材溶液。照TLC[1]法試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液15 μL，對(duì)照藥材10 μL，陰性樣品溶液15 μL，點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（14∶6∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的黃色斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。淫羊藿的TLC見(jiàn)圖4。

2.1.5 茜草的TLC鑒別 取本品30 g，研細(xì)，置錐形瓶中，加甲醇溶液40 mL，超聲處理 20 min，濾過(guò)，濾液蒸干。殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚層，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；同時(shí)取缺茜草的陰性樣品3 g和對(duì)照藥材0.5 g，同法制成陰性對(duì)照溶液和對(duì)照藥材溶液；再取大葉茜草素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.125 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC[1]法試驗(yàn)，吸取供試品溶液15 μL，陰性樣品溶液15 μL，對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠H薄層板上，以石油醚（60～90℃）-丙酮（12∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的綠色熒光斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無(wú)干擾。茜草的TLC見(jiàn)圖5。

圖3 何首烏的TLC1～3.供試品；4.何首烏對(duì)照藥材；5.大黃素對(duì)照品；6.陰性對(duì)照Fig 3 TLC of Polygonum multiflorum1～3.test samples；4.Radix Polygoni Multiflori reference substance；5.emodin control；6.negative control

圖4 淫羊藿的TLC1～3.供試品；4.淫羊藿對(duì)照藥材；5.陰性對(duì)照Fig 4 TLC of Epimedii folium1～3.test samples；4.Herba Epimedii reference substance；5.negative control

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含20.2 μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備[5]取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過(guò)，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸（0～30 min：27∶73→30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30℃。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。色譜見(jiàn)圖6。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，注入液相色譜儀，依法測(cè)定。以淫羊藿苷進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝2.3953X－1.4124（r＝0.9999）。結(jié)果表明，淫羊藿苷進(jìn)樣量在20.2～404.0 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

圖5 茜草的TLC1～3.供試品；4.茜草對(duì)照藥材；5.大葉茜草素對(duì)照品；6.陰性對(duì)照Fig 5 TLC of Rubiae Radix ET Rhizoma1～3.test samples；4.Rubiae Radix ET Rhizoma reference substance；5.Mollugin reference substance；6.negative control

圖6 高效液相色譜圖A.淫羊藿苷對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照Fig 6 HPLC chromatogramsA.icariin control；B.test sample；C.negative control

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述淫羊藿苷對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.34%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取扶正固本顆粒（批號(hào)：090401）適量，共6份，研細(xì)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果，淫羊藿苷平均含量為0.14255 mg·g-1，RSD＝1.57%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液適量，室溫下于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，依法測(cè)定。結(jié)果，RSD＝1.04%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品（批號(hào)：090401）適量，共6份，精密稱定，分別精密加入淫羊藿苷對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算樣品中淫羊藿苷的含量。結(jié)果，3批樣品中淫羊藿苷的含量分別為2.14、2.01、2.16 mg/袋。根據(jù)此結(jié)果，暫定本品每袋含淫羊藿以淫羊藿苷（C33H40O15）計(jì)，不得少于2.0 mg。

3 討論

本研究曾參考藥典的提取方法，結(jié)果大葉茜草素未被檢出。試驗(yàn)改進(jìn)了茜草的提取方法，樣品中大葉茜草素得到了很好的分離；另外大葉茜草素受熱易分解，乙醚萃取溶液應(yīng)在室溫?fù)]干，不能水浴加熱。

按照2005年版《中國(guó)藥典》方法對(duì)淫羊藿進(jìn)行TLC鑒別時(shí)發(fā)現(xiàn)，樣品背景顏色很深，干擾嚴(yán)重。本研究采用D-101大孔吸附樹(shù)脂對(duì)樣品進(jìn)行純化，去除背景的干擾，該方法可以很好地控制扶正固本顆粒中淫羊藿的質(zhì)量。

淫羊藿苷含量測(cè)定時(shí)，考查了提取溶劑、提取時(shí)間和流動(dòng)相等測(cè)定條件。研究中發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)出峰時(shí)間有較大干擾，溫度較低時(shí)淫羊藿苷峰與雜質(zhì)峰有疊加，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例仍不能達(dá)到分離效果，所以色譜柱溫度應(yīng)控制為30℃。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄31.

[2]賈金萍，秦雪梅，邢 婕，等.黃芩百部配伍過(guò)程中主要活性成分的變化研究[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40（9）：812.

[3]張 紅，張龔之，李 革，等.舒冠通脈膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2008，19（30）：2371.

[4]陳 林，陳鴻平，劉友平.抗氧化口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（2）：125.

[5]周春燕，王正俊，嚴(yán)曉星.仙靈骨葆顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].安徽醫(yī)藥，2008，12（1）：16.