孫 蓮，阿合買提江，馬曉麗，古力包斯坦·巴拉提（新疆醫(yī)科大學藥學院化學教研室，烏魯木齊市 830011）

桑葉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉。本品性寒，味甘、苦，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目、滋陰補血、益肝通氣、降壓利尿之功能，《神農(nóng)本草經(jīng)》稱其為“神仙葉”，是常用中藥之一[1]。藥桑是新疆獨特的品種之一，是國內(nèi)唯一的花性染色體倍數(shù)為22倍體的桑品種，是新疆目前桑品種分類鑒定中唯一的黑桑（M.nigra Linn.）種，藥用價值極高。現(xiàn)代藥理研究證明，桑葉具有降血糖、降血壓、抗菌和抗病毒等多種藥理活性，能預防和治療糖尿病[2，3]。桑葉中的黃酮類成分有蘆丁、槲皮素、異槲皮苷等，為桑葉中主要的功效成分，具有很好的降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤[4]和抗菌作用，因此分析測定桑葉中黃酮類成分對開發(fā)利用新疆的桑葉資源具有重要意義。已報道的關(guān)于對桑葉中黃酮類成分的分析方法主要有分光光度法和高效液相色譜法[5，6]，利用高效毛細管電泳（HPCE）法同時測定桑葉中蘆丁、槲皮素、異槲皮苷與綠原酸含量的研究尚未見報道[7]。因此，筆者采用HPCE法同時測定新疆藥桑葉中上述4種主要功效成分的含量，以為新疆藥桑的開發(fā)利用提供基礎研究數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

P/ACETMDQ型HPCE儀（壓力進樣，二極管陣列檢測器，檢測波長為254 nm，用karat 32.0軟件控制儀器操作和數(shù)據(jù)采集）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

槲皮素（批號：10081-9905）、蘆丁（批號：10080-9705）、綠原酸（批號：110753-200413）、異槲皮苷（批號：1106634）對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、NaOH均為分析純，硼砂為優(yōu)級純；藥桑葉采自新疆喀什，經(jīng)新疆醫(yī)科大學藥學院天然藥物教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：毛細管柱（50 cm×75 μm，id）；電泳緩沖液：50 mmol·L-1硼砂溶液（pH 9.6）；柱溫：25 ℃；電壓：20 kV；檢測波長：254 nm。毛細管柱使用前用0.1 mol·L-1NaOH、水和電泳緩沖液分別沖洗1、2、3 min，在此色譜條件下測得混合對照品與供試品溶液的色譜圖見圖1。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取過40目篩的藥桑葉粉末1.0 g，置具塞三角瓶中，加甲醇20 mL，60℃超聲提取30 min，提取2次，過濾，合并濾液，置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。用時過0.45 μm濾膜。

2.3 對照品貯備液的制備

圖1 高效毛細管電泳圖A.混合對照品；B.桑葉供試品；1.蘆??；2.異槲皮苷；3.綠原酸；4.槲皮素Fig 1 HPCEA.mixed control；B.M.nigra sample；1.rutin；2.isoquercitrin；3.chlorogenic acid；4.quercetin

分別精密稱取干燥至恒重的蘆丁、槲皮素、異槲皮苷與綠原酸對照品，依次為8.8、7.6、5.7、6.6 mg，置10 mL容量瓶中，加少量甲醇使之溶解，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為0.88（蘆丁）、0.76（槲皮素）、0.57（異槲皮苷）、0.66（綠原酸）mg·mL-1的對照品貯備液，4℃貯藏，備用。

2.4 標準曲線的制備

精密吸取蘆丁、槲皮素、異槲皮苷與綠原酸對照品貯備液各1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成混合對照品溶液。分別進樣5、10、15、20、25 μL，照上述色譜條件測定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，對照品溶液的濃度（X）為橫坐標，制備標準曲線。4種黃酮類成分的標準曲線、相關(guān)系數(shù)與線性范圍見表1。

表1 4種黃酮類成分的標準曲線、相關(guān)系數(shù)與線性范圍Tab 1 Standard curves，correlation coefficient and linear range of 4 kinds of total flavonoids

2.5 精密度試驗

在上述色譜條件下，將混合對照品溶液連續(xù)進樣5次，每次20 μL，測定4種黃酮類成分的峰面積。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、綠原酸與槲皮素峰面積的RSD分別為1.9%、2.1%、2.6%、2.9%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

稱取藥桑葉粉末適量，共6份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，測定4種黃酮類成分的峰面積，代入回歸方程計算含量。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、綠原酸與槲皮素含量的RSD分別為1.7%、2.8%、3.6%、1.6%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別于0、2、8、12、24 h進樣20 μL，測定4種黃酮類成分的峰面積。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、綠原酸與槲皮素峰面積的RSD分別為1.6%、3.0%、3.7%、2.6%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知蘆丁、槲皮素、綠原酸和異槲皮苷含量的藥桑葉粉末適量，共12份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，其中3份為本底樣，另9份中，每3份分別加低、中、高濃度的混合對照品溶液，進樣20 μL，測定4種黃酮類成分的峰面積，代入回歸方程計算蘆丁、槲皮素、綠原酸和異槲皮苷的含量及平均回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品含量測定

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

取5批藥桑葉粉末適量，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣20 μL，測定4種黃酮類成分的峰面積，代入回歸方程計算含量（n＝5）。結(jié)果，蘆丁、異槲皮苷、綠原酸、槲皮素的含量分別為0.72、0.70、2.15、0.29 mg·g-1，RSD分別為3.2%、2.8%、2.1%、1.8%。

3 討論

3.1 緩沖液體系及濃度的選擇

試驗比較了50mmol·L-1NaH2PO4溶液、50 mmol·L-1NaH2PO4-甲醇、50 mmol·L-1硼砂溶液3種緩沖液體系，考察了各緩沖液體系對分離效果的影響。結(jié)果表明，50 mmol·L-1硼砂溶液為緩沖液體系時，色譜峰尖銳且分離效果最好。試驗同時考察了硼砂溶液的濃度（20、30、40、50、60 mmol·L-1），發(fā)現(xiàn)其濃度為50 mmol·L-1時各峰分離效果最好。故本試驗選擇50 mmol·L-1硼砂溶液為電泳緩沖溶液。

3.2 緩沖液體系pH值的選擇

緩沖液體系pH值是影響分離度的重要因素。試驗在固定分離電壓與進樣時間的前提下，比較了緩沖液pH值為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0時對分離度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當pH值在低于8.0與高于10.0時，分離效果較差，因此確定緩沖液最佳pH值范圍在8.0～10.0內(nèi)。再在此范圍內(nèi)每隔0.2個單位進行系統(tǒng)考察，結(jié)果表明當緩沖液的pH值為9.6時，蘆丁、槲皮素、異槲皮苷與綠原酸4種成分的峰形最好，且與其他物質(zhì)有很好的分離，故本試驗選擇緩沖液體系的最佳pH值為9.6。

3.3 分離電壓的選擇

試驗比較了分離電壓分別為20、25、30、35 kV時對分離度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當分離電壓低于20 kV時，遷移時間延后且峰形有拖尾現(xiàn)象；當分離電壓高于25 kV時，遷移時間提前且分離效果不好；只有當分離電壓為20 kV時，蘆丁、槲皮素、異槲皮苷與綠原酸能得到較好的分離，且遷移時間與峰面積適中，故本試驗選擇分離電壓為20 kV。

3.4 進樣時間的選擇

進樣時間是影響供試品分離效果的關(guān)鍵因素，進樣時間過短將導致靈敏度低，進樣時間過長將使毛細管負載增加，并使峰形加寬。本試驗采用重力進樣，在進樣高度為10 cm時依次考察了進樣時間5、15、20、25、30、35、40 s對供試品中蘆丁、槲皮素、異槲皮苷與綠原酸的峰面積及遷移時間的影響，發(fā)現(xiàn)5 s為最佳進樣時間。

3.5 結(jié)論

由含量測定結(jié)果可知，新疆藥桑葉主要的黃酮類成分中綠原酸的含量最高，蘆丁和異槲皮苷的含量較高，槲皮素的含量較低，蘆丁和異槲皮苷的含量是槲皮素的2倍，因此在高效液相色譜法中槲皮素常檢測不到。綜上，本方法簡便、快速、重復性好，結(jié)果準確、可靠，可用于桑葉中4種主要黃酮類成分的含量測定和質(zhì)量檢測。

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