鄭宇紅，白學(xué)敏，黃劍（.浙江溫州市中醫(yī)院，溫州市 35000；.浙江溫州市醫(yī)藥科學(xué)研究所，溫州市 35000）

活血散瘀灌腸液是浙江溫州市中醫(yī)院的協(xié)定復(fù)方中藥制劑，由丹參、大血藤、三棱、莪術(shù)等藥味經(jīng)浸泡、蒸餾提取、濃縮、滅菌、灌裝等工藝而制成。其具有活血化瘀、消腫止痛等功能，臨床用于婦女盆腔炎性腫塊的灌腸治療。該制劑目前尚未制定含量測定指標(biāo)，故筆者采用高效液相色譜（HPLC）法[1]建立了活血散瘀灌腸液中丹參水溶性成分丹參素的含量測定方法，以確保該制劑的質(zhì)量[2]。

1 儀器與試藥

1525型HPLC儀、2487型紫外檢測儀（美國Waters公司）；AB204型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

丹參素鈉對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110855-200508）；活血散瘀灌腸液（批準(zhǔn)文號：浙藥制Z20050273，批號：20100128、20100129、20100309、20100310、20100526、20100715）及陰性樣品均由溫州市中醫(yī)院制劑室制備；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水-冰醋酸（7∶92.5∶0.5）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：280 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取丹參素鈉對照品適量，用流動相稀釋成含丹參素0.1 mg·mL-1的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取活血散瘀灌腸液1.00 mL，置10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

除去丹參，按照活血散瘀灌腸液處方及制備工藝制得陰性樣品。精密量取陰性樣品1.00 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取上述對照品溶液（含丹參素0.1 mg·mL-1）、供試品溶液與陰性對照溶液各20μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定。結(jié)果表明，樣品中其他成分對丹參素的測定無干擾；理論板數(shù)按丹參素鈉峰計(jì)算為9004，分離度R＝2.78（＞1.5）。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.丹參素鈉Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.sodium danshensu

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取對照品溶液（丹參素含量為0.1 mg·mL-1）1.00、2.00、5.00、7.00、10.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到含丹參素0.01、0.02、0.05、0.07、0.10 mg·mL-1的系列對照品溶液。用0.45μm微孔濾膜濾過，按上述色譜條件分別進(jìn)樣20μL，測定各系列對照品溶液中丹參素的吸收峰面積。以峰面積積分值（A）對濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝14268340c－10057（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，丹參素檢測濃度在0.01～0.10 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密量取對照品溶液（丹參素含量為0.02 mg·mL-1）20μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.41%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批號的樣品適量，照“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測定丹參素的含量。結(jié)果，樣品中丹參素的平均含量為0.640 mg·mL-1，RSD＝1.09%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，分別于0、6、12、18、24 h按上述色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。結(jié)果，RSD＝1.22%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)[3]

精密量取已知含量（0.528 mg·mL-1）的同一批樣品共6份，每份0.50 mL，分別置10 mL容量瓶中，再精密加入對照品溶液（丹參素含量為0.05 mg·mL-1）5.00 mL，用流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得6份加樣回收率供試溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Result of recovery tests（n＝6）

2.11 樣品含量測定

取6批樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測定樣品中丹參素的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

活血散瘀灌腸液為中藥復(fù)方制劑，有一定的黏稠度，而待測成分含量不高，在對樣品進(jìn)行處理時(shí)，筆者用流動相稀釋，采用普通濾紙過濾以除去不溶性雜質(zhì)和干擾物質(zhì)，再用0.45μm微孔濾膜過濾，可得到較滿意的澄清供試品溶液。也曾采用高速離心（5000 r·min-1）后再用微孔濾膜過濾的方法處理，效果與前者相當(dāng)，故采用前者處理。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of content determination of sample（n＝6）

本試驗(yàn)最關(guān)鍵的一點(diǎn)是確定流動相。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[4～6]，比較了多種流動相對樣品峰形和分離情況的影響，最后確定流動相為甲醇-水-冰醋酸（7∶92.5∶0.5）。若增加甲醇的量，會加快出峰時(shí)間，因此用甲醇來清洗色譜柱，以加速殘留雜質(zhì)盡快出峰；添加少量冰醋酸能使分離效果更好。

活血散瘀灌腸液成分復(fù)雜，檢測條件下溫度對分離效果和保留時(shí)間有一定的影響。經(jīng)過比較試驗(yàn)，選擇柱溫25℃，既能避免出峰時(shí)間過長，又能得到分離效果滿意并穩(wěn)定的色譜圖。

6批樣品含量測定結(jié)果表明，活血散瘀灌腸液中丹參素的含量差異較大，這一方面與每批樣品的原料差異有關(guān)；另一方面與生產(chǎn)工藝中濃縮定容的差異有關(guān)。

試驗(yàn)測得樣品中丹參素的平均含量為0.509 mg·mL-1，因此建議活血散瘀灌腸液以丹參素為定量標(biāo)準(zhǔn)，即每1 mL含丹參素不少于0.4 mg（0.509×80%≈0.4），以保證其質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄36-38.

[2]薛繼雄，周 輝，劉 萌.高效液相色譜法測定消炎灌腸液中丹參水溶性成分的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，24（1）：66.

[3]黃仕孫，王艷寧，高桂娥，等.中藥退黃外洗液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥房，2010，21（15）：1399.

[4]張友芹，張春林，邵浩明，等.HPLC法測定丹參藥材中丹參素的含量[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2000，28（3）：68.

[5]唐旭利，劉 靜，李國強(qiáng)，等.丹參藥材水溶性成分HPLC化學(xué)指紋圖譜研究[J].中成藥，2008，30（3）：313.

[6]李 桃，王春娥.高效液相色譜法測定丹參藥材中丹參素的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005，25（9）：832.