陳娜，劉毅（1.天津市兒童醫(yī)院，天津市 300074；.天津藥物研究院，天津市 300193）

復(fù)方益腎軟膠囊是由知母、黃柏、牡丹皮、山茱萸、杜仲等多味中藥制成的復(fù)方制劑，具有滋陰降火、補(bǔ)益肝腎的功效。其有效成分為鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚等。為了有效控制該制劑的質(zhì)量，本試驗(yàn)應(yīng)用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時(shí)對(duì)制劑中的有效成分鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚進(jìn)行含量測定[1～5]，方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為該制劑的質(zhì)控方法。

1 儀器與試藥

HP1100系列HPLC儀，包括G1310A泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314A VWD可變波長檢測器、HP Rev.A.0501化學(xué)工作站（美國Agilent公司）；SD-3200型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

甲醇、乙腈均為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純；丹皮酚（批號(hào)：708-9003，供含量測定用）、鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)：732-9002，供含量測定用）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：713-9906，供含量測定用）對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所；復(fù)方益腎軟膠囊（天津市兒童醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)：20100201、20100202、20100203）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇

取丹皮酚對(duì)照品溶液、鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液、鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液和流動(dòng)相，在200～400 nm波長之間進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長為265 nm，故選擇265 nm作為同時(shí)測定這3種成分的檢測波長。

2.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液（B，pH 3.10），梯度洗脫（0～30 min，27%A∶73%B→50%A∶50%B；30～35 min，50%A∶50%B→27%A∶73%B；35～40 min，27%A∶73%B→27%A∶73%B）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 （1）對(duì)照品貯備液的制備：精密稱取鹽酸巴馬汀對(duì)照品5.19 mg、鹽酸小檗堿對(duì)照品8.44 mg，置同一50 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液。精密稱取丹皮酚對(duì)照品9.81 mg，置25 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為丹皮酚對(duì)照品貯備液。（2）混合對(duì)照品溶液的制備：精密吸取鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液1 mL、丹皮酚對(duì)照品貯備液2 mL，置同一25 mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚的濃度分別為4.152、6.752、31.390 μg·mL-1）。

2.3.2 供試品溶液 取本品，研成細(xì)粉，取約0.4 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入1%鹽酸甲醇-水（7∶3）約20 mL，超聲（功率：180 W，頻率：35 kHz）提取30 min，取出，放冷，用相應(yīng)溶劑稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm有機(jī)濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液 按本品處方與工藝制備黃柏和牡丹皮缺味樣品，照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.4 方法專屬性考察

在上述色譜條件下，分別取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對(duì)照在鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚色譜峰位置處無相應(yīng)峰出現(xiàn)；與其相鄰的其他成分色譜峰達(dá)到基線分離，對(duì)含量測定結(jié)果無影響。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.鹽酸巴馬?。?.鹽酸小檗堿；3.丹皮酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control；1.palmatine hydrochloride；2.berberine hydrochloride；3.paeonolin

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取鹽酸巴馬汀對(duì)照品貯備液（0.1038 mg·mL-1）與鹽酸小檗堿對(duì)照品貯備液（0.1688 mg·mL-1）0.2、0.5、1.0、3.0、5.0 mL，置25 mL量瓶中，再分別精密量取丹皮酚對(duì)照品貯備液（0.3924 mg·mL-1）0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置25 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，讀取峰面積。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸巴馬汀的回歸方程為Y＝4018Χ+1.52（r＝0.9999，n＝5）；鹽酸小檗堿的回歸方程為 Y＝5801.5Χ－95.2（r＝0.9999，n＝5）；丹皮酚的回歸方程為Y＝5230.3Χ－10.03（r＝0.9999，n＝5）。結(jié)果表明，三者的進(jìn)樣量分別在0.01661～0.41520、0.02701～0.67520、0.15700～1.25570 μg范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一混合對(duì)照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚峰面積的RSD分別為0.88%、0.61%、0.88%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：20100201）適量，研勻，精密稱取6份，照“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按樣品測定方法進(jìn)行測定。結(jié)果，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚含量的RSD分別為1.17%、1.04%、0.66%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液適量，于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h，在上述色譜條件下測定，對(duì)照品隨行。結(jié)果，對(duì)照品溶液中鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚峰面積的RSD分別為1.19%、0.77%、1.16%（n＝6）；供試品溶液中鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、丹皮酚峰面積的RSD分別為1.58%、0.71%、0.76%（n＝6），表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：20100201）適量，研勻，精密稱定6份，每份約0.2 g，分別置25 mL容量瓶中，加入0.5 mL鹽酸巴馬汀（0.1038 mg·mL-1）、鹽酸小檗堿（0.1688 mg·mL-1）對(duì)照品溶液和1.0 mL丹皮酚（0.3924 mg·mL-1）對(duì)照品溶液，分別加入1%鹽酸甲醇-水（7∶3）約20 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照樣品測定方法進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果分別見表1～表3。

表1 鹽酸巴馬汀加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test of palmatine hydrochloride（n＝6）

表2 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of berberine hydrochloride（n＝6）

表3 丹皮酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery test of paeonol（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品（批號(hào)：20100201、20100202、20100203）適量，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法測定鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和丹皮酚的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果（mg·g-1，n＝3）Tab 4 Results of content determination of samples（mg·g-1，n＝3）

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

稱取樣品適量，共4份，分別置25 mL量瓶中，分別加入不同的溶劑[70%甲醇、1%鹽酸甲醇、甲醇-0.1%磷酸水溶液（1∶1）、1%鹽酸甲醇-水（7∶3）]約20 mL，超聲提取30 min，取出，放至室溫，用相應(yīng)溶劑稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm有機(jī)濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液進(jìn)行測定。結(jié)果表明，用1%鹽酸甲醇-水（7∶3）作提取溶劑所測得樣品含量最高，因此采用它作為提取溶劑。

3.2 提取方法的考察

稱取樣品適量，共5份，分別置25 mL量瓶中，分別加入1%鹽酸甲醇-水（7∶3）約20 mL，采用不同的提取方法（加熱回流30 min、振搖30 min、超聲處理15 min、超聲處理30 min、超聲處理50 min）進(jìn)行處理后放至室溫，用原溶劑稀釋至刻度，搖勻，過0.45μm有機(jī)濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液進(jìn)行測定。結(jié)果表明，振搖提取的各成分含量均較低；而對(duì)鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿而言，超聲和加熱回流的提取方法無明顯差異，但對(duì)丹皮酚而言，加熱回流對(duì)其含量有影響。因此，選定超聲為提取樣品的方法。進(jìn)一步通過超聲時(shí)間的比較發(fā)現(xiàn)，超聲30 min時(shí)3種成分基本提取完全，故選定超聲30 min為宜。

3.3 對(duì)含量測定的分析討論

黃柏為本方君藥，故選用其有效成分鹽酸小檗堿與鹽酸巴馬汀作為含量測定指標(biāo)，采用2005年版《中國藥典》（一部）黃柏項(xiàng)下的含量測定方法，效果較好。

考慮將鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚（牡丹皮的主要成分）采用同一流動(dòng)相系統(tǒng)，比較了[1，2]乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液與乙腈-0.1%磷酸（50∶50）每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g 4種流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果，前3種流動(dòng)相系統(tǒng)下鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的保留時(shí)間適宜，而丹皮酚的保留時(shí)間大約在40 min，保留時(shí)間較長；第4種流動(dòng)相系統(tǒng)能在很短的時(shí)間內(nèi)將3種成分分開，但由于此系統(tǒng)中離子對(duì)的特性，使各組分保留時(shí)間很不穩(wěn)定，在此基礎(chǔ)上采用梯度洗脫的方法進(jìn)一步試驗(yàn)，最后通過優(yōu)化選擇，確定出乙腈和0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液兩相進(jìn)行線性梯度洗脫系統(tǒng)。

[1]國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：119.

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