熊愛珍（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌市 330006）

抗溶血顆粒是根據(jù)醫(yī)院使用多年臨床經(jīng)驗(yàn)方選用黃芩、茵陳、山藥、制大黃、甘草等制備的抗溶血合劑改變劑型而成，具有清熱祛濕、利膽退黃等功效[1，2]。能有效降低孕婦血清抗A（B）抗體效價(jià)，起到預(yù)防和治療母嬰ABO血型不合的作用[3]。

本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代制劑技術(shù)的研究思路和方法，根據(jù)各藥材有效成分的理化性質(zhì)，設(shè)計(jì)了工藝路線，并建立了相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以確保制劑的質(zhì)量穩(wěn)定、安全有效。

1 儀器與試藥

2487紫外檢測(cè)器、717高效液相色譜（HPLC）儀、600泵（美國Waters公司）；sb3200超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Sartorius-BT25s電子分析天平（德國賽多利斯）；FA-2004分析天平（上海精密儀器儀表有限公司）。

黃芩、茵陳、山藥、制大黃、甘草飲片均購自江西匯仁集團(tuán)醫(yī)藥科研營銷有限公司，批號(hào)分別為0812013、0812004、081008、0812005、0812005；黃芩苷、綠原酸、大黃素、甘草次酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為110715-200514、110753-200413、110756-200110、110723-200411）；硅膠G（青島海洋化工有限公司，批號(hào)：200675）；甲醇為色譜純，水為重蒸鎦水，其他試劑均為分析純。

2 處方與制備

2.1 處方

黃芩、茵陳、山藥、制大黃、甘草等。

2.2 制備

將黃芩、茵陳、山藥、制大黃、甘草等藥材粉碎成粗粉，加10倍量的60%乙醇，回流提取3次，每次1 h，得提取液[4]，過濾，回收乙醇、濃縮得流浸膏，加水沉淀除去雜質(zhì)，減壓濃縮得相對(duì)密度為1.31的濃縮物，加入3.5倍混合輔料（糊精∶乳糖∶糖粉），混合輔料的比例為2∶4∶1，混合制軟材，然后過10目篩制粒，70～80℃干燥，再過10目篩，整粒過80目篩篩去細(xì)粉，即得[5]。

3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

3.1 性狀

本品為黃棕色至棕褐色的顆粒，味微苦。

3.2 定性鑒別

3.2.1 黃芩的TLC鑒別 取本品10 g，加水30 mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH至2～3，置聚酰胺小柱（30～60目，1 g，內(nèi)徑1.2～1.5 cm）上，用乙酸乙酯100 mL洗脫，棄去初洗脫液3 mL，收集續(xù)洗脫液，取上清液，蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液；另取除黃芩外，其余各藥材按處方量投料制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液；再取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[6]試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。黃芩的TLC見圖1。

3.2.2 茵陳的TLC鑒別 取本品10 g，研細(xì)，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；另取除茵陳外，其余各藥按處方量投料制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液；再取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[6]試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10 μL，對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。茵陳的TLC見圖2。

3.2.3 大黃的TLC鑒別 取 本品15 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸4 mL，加熱回流提取30 min，立即冷卻，用乙醚振搖提取3次，每次25 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液；另取除大黃外，其余各藥按處方量投料制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液；再取大黃素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[6]試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各15 μL，對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏后日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。大黃的TLC見圖3。

3.2.4 甘草的TLC鑒別 取本品10 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，加熱回流提取1 h，濾過，濾液加3倍量乙醚，放置使沉淀，濾過，殘?jiān)欲}酸2 mL、三氯甲烷30 mL，加熱提取1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液；另取除甘草外，其余各藥按處方量投料制成陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液；再取甘草次酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[6]試驗(yàn)，分別吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各15 μL，對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-石油醚（30～60℃）-乙酸乙脂-冰醋酸（10∶5∶4∶0.6）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無干擾。甘草的TLC見圖4。

圖1 黃芩的TLC1.陰性對(duì)照；2～4.供試品；5.黃芩苷對(duì)照品Fig 1 TLC of Scutellaria baicalensis1.negative control；2～4.test samples；5.baicalin control

圖2 茵陳的TLC1～3.供試品；4.陰性對(duì)照；5.綠原酸對(duì)照品Fig 2 TLC of Herba Artemisiae Scopariae1～3.test samples；4.negative control；5.chlorogenic acid control

圖3 大黃的TLC1.大黃素對(duì)照品；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照Fig 3 TLC of Radix Et Rhizoma Rhei1.emodin control；2～4.test samples；5.negative control

3.3 檢查

本品應(yīng)為黃棕色或棕褐色顆粒，其他應(yīng)符合顆粒劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定[6]。

3.4 含量測(cè)定

3.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（50∶45∶0.2）；流速：0.9 mL·min-1；檢測(cè)波長：280 nm[7]；柱溫：40 ℃。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。黃芩苷與雜質(zhì)峰分離良好，雜質(zhì)對(duì)測(cè)定無干擾，峰形理想。色譜見圖5。

圖4 甘草的TLC1.甘草次酸對(duì)照品；2.陰性對(duì)照；3～5.供試品Fig 4 TLC of Radix Glycyrrhizae1.glycyrrhetinic control；2.negative control；3～5.test samples

圖5 高效液相色譜圖A.陰性對(duì)照；B.黃芩苷對(duì)照品；C.供試品Fig 5 HPLC chromatogramsA.negative control；B.baicalin control；C.test sample

3.4.2 溶液的制備 （1）對(duì)照品溶液：精密稱取于60℃減壓干燥4 h的黃芩苷對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。（2）供試品溶液：取裝量差異項(xiàng)下的本品約2 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）陰性對(duì)照溶液：取除黃芩以外的其他藥材制成的陰性樣品2 g，按供試品溶液方法制成陰性對(duì)照溶液。

3.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱定黃芩苷對(duì)照品11.81 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度；精密量取1、3、5、7、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取上述溶液各20 μL，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積。以對(duì)照品的量（X，μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝2×106X＋26503（r＝0.9998）。結(jié)果表明，黃芩苷進(jìn)樣量在0.236～2.360 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

3.4.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液（59μg·mL-1）20μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果，黃芩苷峰面積積分值的RSD＝0.96%（n＝5），表明儀器精密度良好。

3.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“3.4.2”項(xiàng)下（2）法制成的供試品溶液，再精密吸取對(duì)照品溶液20μL，按上述色譜條件每隔2 h進(jìn)樣1次，測(cè)定10 h內(nèi)的變化。結(jié)果，黃芩苷峰面積積分值的RSD＝1.08%（n＝5），表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品6份，按“3.4.2”項(xiàng)下（2）法分別制成供試品溶液，按上述色譜條件試驗(yàn)。結(jié)果，黃芩苷峰面積積分值的RSD＝1.01%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

3.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品，精密稱定，分別精密加入一定量的黃芩苷對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制成待測(cè)溶液，進(jìn)樣20μL，按上述測(cè)定方法試驗(yàn)，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

3.4.8 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，按“3.4.2”項(xiàng)下（2）法制備供試品溶液，進(jìn)樣20μL，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算黃芩苷含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination（n＝3）

4 討論

取黃芩苷對(duì)照品溶液，用Waters 2487紫外檢測(cè)器在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，測(cè)得黃芩苷最大吸收波長為277 nm和315 nm。參照2005年版《中國藥典》黃芩苷測(cè)定方法[6]，本試驗(yàn)選擇檢測(cè)波長為280 nm。

輔料的種類是影響顆粒成型的關(guān)鍵因素之一。目前，中藥顆粒劑的常用輔料為糖粉、糊精和乳糖，其中乳糖、糖粉可以掩蓋中藥的不良?xì)馕叮缓凰疂櫇窈?，產(chǎn)生較強(qiáng)的黏性使顆粒變得結(jié)實(shí)、圓整，在不斷滾動(dòng)中不容易破碎成細(xì)小顆粒。同時(shí)，糊精、乳糖和糖粉作為賦形劑優(yōu)于淀粉，后者制得的顆粒易吸濕軟化，而且加水溶解后，因淀粉溶解度差，底部有白色沉淀。鑒于前三者所制顆粒成型性較好，溶解后無沉淀產(chǎn)生且顆粒崩解速度加快，制出的顆粒外觀均勻、美觀，故采用糊精、乳糖和糖粉作為抗溶血顆粒的混合輔料。

清膏量與混合輔料的配比是影響顆粒成型的關(guān)鍵因素之一。2005年版《中國藥典》（一部）中要求：輔料量一般不超過清膏量的5倍。通過試驗(yàn)得知，清膏量與混合輔料（糊精∶乳糖∶糖粉）的配比為1∶2.5時(shí)，軟材較軟，制粒時(shí)容易堵塞篩網(wǎng)或成長條形；而配比為1∶3以上時(shí)，上述現(xiàn)象不太明顯，軟材易通過篩網(wǎng)，所得顆粒也較圓整。

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