黃洋，賈曉斌，蔣俊，盧映蓉，許巧梅（.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥新型給藥系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，南京市 20028；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，鎮(zhèn)江市 220；.鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局國家食品添加劑及調(diào)味品檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鎮(zhèn)江市 22008）

中藥復(fù)方三草方（Sancaofang，SCF）是江蘇省中醫(yī)藥研究院治療非小細(xì)胞性肺癌的臨床驗(yàn)方，由夏枯草、白花蛇舌草、仙鶴草、墨旱蓮、山茱萸等5味藥材組成，具有滋補(bǔ)肝腎、清熱散結(jié)、抗癌之功效，可以改善癥狀，提高患者的生存質(zhì)量，減少復(fù)發(fā)機(jī)會，延長患者的生存期[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，SCF各味藥材成分復(fù)雜，與抗腫瘤有關(guān)的化學(xué)成分主要為萜類、黃酮類、甾醇類、有機(jī)酸類等[2，3]。本課題組前期研究在“三個層次多維結(jié)構(gòu)”[4，5]組分結(jié)構(gòu)理論指導(dǎo)下對SCF抗肺癌物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了探索。結(jié)果表明，SCF抗肺癌是多種組分（組分群）共同作用的結(jié)果，其發(fā)揮抗肺癌作用的組分主要包括黃酮、酚酸以及萜類組分。本文報(bào)道筆者在前期研究的基礎(chǔ)上，從組分、成分不同層次上合理選擇考察指標(biāo)，對SCF抗肺癌有效組分群的提取工藝進(jìn)行研究，為該復(fù)方后續(xù)的研究以及制劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

UV-28型紫外-可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；高效液相色譜儀，包括717自動進(jìn)樣系統(tǒng)、2996檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）。

夏枯草、白花蛇舌草、仙鶴草、墨旱蓮、山茱萸藥材均購于安徽亳州滕王藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地分別為安徽、江西、安徽、浙江、安徽，批號均為20080815，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳德康教授鑒定為真品；咖啡酸、蘆丁、熊果酸、齊墩果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為885-200001、100080-200707、11074-200516、110709-200304）；迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海順勃生物工程技術(shù)有限公司，批號：080420，含量≥98%）；甲醇、乙腈、醋酸為色譜純，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

RPMI-1640培養(yǎng)粉（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO，廣東光華化學(xué)廠有限公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，南京生興生物有限公司）；滅菌胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞株由中國中醫(yī)科學(xué)院贈送。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的含量測定[6]

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密秤取干燥至恒重的蘆丁對照品10.33 mg，置于50 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品溶液。精密量取該對照品溶液0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加水至8 mL，加5%硝酸鈉1 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，放置6 min，加4.3%氫氧化鈉溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，置比色杯中，于510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁檢測濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A＝12.356c+0.0009（r＝0.9994）。

2.1.2 樣品含量測定 精密稱量SCF粉未樣品適量，用適量無水乙醇稀釋成含生藥為100 mg·mL-1的溶液，過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液為供試品溶液。取該溶液適量，分別置25 mL容量瓶中，各加水至8 mL，加5%硝酸鈉1 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4.3%氫氧化鈉溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，置比色杯中，于510 nm波長處測定吸光度，并計(jì)算供試品溶液中總黃酮含量。

2.2 總萜類的含量測定[7]

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密秤取干燥至恒重的熊果酸對照品2.16 mg，置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，即得蘆丁對照品溶液。精密量取該對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分別置于 10 mL 具塞試管中，于100℃水浴揮干，各加5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，高氯酸0.8 mL，置60℃水浴中加熱10 min，取出置冰水浴中冷卻5 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，置比色杯中，于548 nm波長處測定吸光度。以熊果酸檢測濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A＝22.417c+0.1301（r＝0.9999）。

2.2.2 樣品含量測定 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取該溶液適量，置10 mL具塞試管中，于100℃水浴揮干，各加5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，置60℃水浴中加熱10 min，取出置冰水浴中冷卻5 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，置比色杯中，于548 nm波長處測定吸光度，并計(jì)算供試品溶液中總萜類含量。

2.3 咖啡酸、迷迭香酸、蘆丁的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：330 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸，梯度洗脫（0→20→35 min，甲醇的體積為25%→40%→40%）。

2.3.2 樣品含量測定 精密稱取咖啡酸、迷迭香酸和蘆丁對照品適量，加甲醇制成濃度分別為0.0193、0.1274和0.3700 mg·mL-1的對照品溶液；精密稱取SCF樣品適量，用75%乙醇超聲提取30 min，過濾，取續(xù)濾液適量，濃縮至近干，加甲醇稀釋至濃度為生藥量100 mg·mL-1，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。在上述色譜條件下，取供試品溶液進(jìn)樣測定，根據(jù)回歸方程[咖啡酸：Y＝5×106X+895.05（r＝0.9999），線性范圍為0.0060～0.1932 μg；迷迭香酸：Y＝2×106X+3361.3（r＝0.9999），線性范圍為0.0398～1.2740 μg；蘆?。篩＝8×105X+9929.7（r＝0.9999），線性范圍為0.1156～3.700 μg]計(jì)算3種成分的含量。

2.4 齊墩果酸的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL；乙腈-pH7.6磷酸水溶液（55∶45）等度洗脫。

2.4.2 樣品含量測定 精密稱取齊墩果酸對照品適量，加甲醇制成濃度0.1100 mg·mL-1的對照品溶液；精密稱取SCF樣品適量，用75%乙醇超聲提取30 min，過濾，取續(xù)濾液適量，濃縮至近干，加甲醇稀釋至濃度為生藥量100 mg·mL-1，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。在上述色譜條件下，取供試品溶液進(jìn)樣測定，根據(jù)回歸方程[Y＝450411X+1095.6（r＝0.9999），線性范圍為0.0344～1.1000 μg]計(jì)算齊墩果酸的含量。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝

2.5.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素考察結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，影響SCF有效組分群提取工藝的因素主要有乙醇濃度（A）、溶劑用量（B）、提取次數(shù)（C）和提取時間（D）。因此，筆者選其為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)表，以SCF一個復(fù)方量藥材為研究量，以總黃酮、蘆丁、總萜類、齊墩果酸、咖啡酸和迷迭香酸的含量為指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝條件。因素水平見表1；含量測定結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 含量測定結(jié)果Tab 2 Results of content tests

2.5.2 評分方法的制定 SCF各組分均采用綜合評分法。其中黃酮組分將總黃酮和蘆丁含量總系數(shù)設(shè)為1，其中總黃酮系數(shù)0.7，蘆丁系數(shù)0.3，評分公式為得分（Y）＝總黃酮含量/最高組黃酮含量×0.7+蘆丁含量/最高組蘆丁含量×0.3；萜類組分將總萜類和齊墩果酸含量總系數(shù)設(shè)為1，其中總萜類系數(shù)0.7，齊墩果酸系數(shù)0.3，評分公式為得分（Y）＝總萜類含量/最高組萜類含量×0.7+齊墩果酸含量/最高組齊墩果酸含量×0.3；酚酸組分將咖啡酸和迷迭香酸含量總系數(shù)設(shè)為1，其中咖啡酸和迷迭香酸系數(shù)均設(shè)為0.5，評分公式為得分（Y）＝咖啡酸含量/最高組咖啡酸含量×0.5+迷迭香酸含量/最高組迷迭香酸含量×0.5。

2.5.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 根據(jù)上述評分方法，對各組試驗(yàn)進(jìn)行評分，并進(jìn)行直觀分析和方差分析，以優(yōu)選出最佳工藝，結(jié)果分別見表3、表4。

表3 直觀分析Tab 3 Direct-viewing analysis

由表3、表4可知，各指標(biāo)下，D因素一致，均為3次；B、C因素對提取結(jié)果無顯著性影響。其中，B因素的3個水平提取結(jié)果相近，為了節(jié)省乙醇用量，選擇8倍量；C因素中水平2、3提取結(jié)果相近，并高于水平1，為了節(jié)省提取時間，選擇水平2即2 h。但以黃酮、三萜組分為指標(biāo)，在A因素上不一致，按黃酮組分為指標(biāo)應(yīng)選60%乙醇，按萜類組分為指標(biāo)應(yīng)選75%乙醇。為了確定最終工藝，以A1B1C2D3、A2B1C2D3工藝為研究對象，結(jié)合細(xì)胞藥效試驗(yàn)進(jìn)行篩選，以半數(shù)抑制濃度（IC50）為指標(biāo)進(jìn)行藥效評價，確定最終工藝。

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

2.6 藥效學(xué)試驗(yàn)

2.6.1 試驗(yàn)方法 通過研究2種工藝提取物對人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞增殖活性的影響確定最終工藝[8]。取對數(shù)生長期細(xì)胞使其脫壁，用10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液，以每孔4×104個細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)液100 μL。將培養(yǎng)板移入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液90 μL，再加入10 μLSCF提取液不同濃度的PBS溶液，經(jīng)初步的預(yù)試驗(yàn)，生藥濃度均設(shè)置為10.0、5.0、2.5、1.0 、0.5 mg·mL-1的濃度梯度。然后移入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)36 h，每個藥物濃度設(shè)6個平行復(fù)孔，設(shè)上下本底對照孔，另設(shè)順鉑（終濃度為25 mg·L-1）陽性對照組和PBS空白對照組。到時間吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液100 μL，然后每孔再加入5 mg·mL-1MTT 溶 液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加DMSO 100 μL，在微量振蕩儀中振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測定吸光度（A）值，檢測波長為550 nm，參比波長為690 nm。IC50值用SPSS10.0軟件進(jìn)行計(jì)算。試驗(yàn)重復(fù)6次。按下式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率：細(xì)胞生長抑制率（%）＝（1－組平均A值/空白對照組平均A值）×100%。不同提取物對SPC-A-1細(xì)胞增殖作用的影響見圖1；不同提取物對SPC-A-1細(xì)胞的IC50見圖2。

2.6.3 試驗(yàn)結(jié)果 由 圖1、圖2可知，在一定濃度范圍內(nèi)，75%乙醇提取物比60%乙醇提取物對SPC-A-1細(xì)胞增殖作用強(qiáng)。與60%乙醇提取物對SPC-A-1細(xì)胞的IC50相比，75%乙醇提取物對SPC-A-1細(xì)胞的IC50有所下降，并有顯著性差異。因此，結(jié)合藥效實(shí)驗(yàn)確定最終工藝為A2B1C2D3，即8倍量75%乙醇，提取3次，每次2 h。

2.7 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

圖1 不同提取物對SPC-A-1細(xì)胞增殖作用的影響（n＝6）Fig1 Effect of different extracts on the proliferation of SPC-A-1 cells（n＝6）

圖2 不同提取物對SPC-A-1細(xì)胞的IC（50±s，n＝6）Fig 2 IC50of different extracts on SPC-A-1 cells（±s，n＝6）

取SCF藥材3份，按上述確定的最佳工藝進(jìn)行提取，合并提取液，濃縮至合適濃度，并按上述方法測定相關(guān)成分的含量。結(jié)果，總黃酮、蘆丁、總萜類、齊墩果酸、咖啡酸、迷迭香酸的含量分別為32.817、1.066、25.853、0.324、0.037、0.536 mg·g-1，均較高，表明工藝重現(xiàn)性良好、可行。

3 討論

SCF抗肺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)是由黃酮組分、萜類組分以及酚酸組分共同組成的，因此筆者選擇有效組分群作為研究對象進(jìn)行提取工藝的研究是科學(xué)的、合理的。

本研究在乙醇濃度這一因素?zé)o法確定的情況下創(chuàng)新性地結(jié)合細(xì)胞藥效模型進(jìn)行了最終的工藝優(yōu)選，篩選出SCF有效組分群的提取工藝為：藥材8倍量75%乙醇，提取3次，每次2 h，并證明提取工藝重現(xiàn)性好，為該復(fù)方的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ)。

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