彭其勝（重慶市涪陵中心醫(yī)院，重慶市 408000）

周圍神經(jīng)缺血再灌注（IR）損傷在臨床上較常見，多繼發(fā)于創(chuàng)傷、血栓形成、斷肢再植、筋膜間隙綜合征、肢體大動脈損傷以及較長時間應(yīng)用止血帶等造成周圍神經(jīng)缺血，在恢復(fù)血流灌注后不僅不能改善神經(jīng)功能，反而進一步加重組織損傷[1]。

紅花（Carthamus tinctorius），又叫草紅、刺紅花、杜紅花、金紅花，為菊科植物紅花的管狀花。紅花是一味傳統(tǒng)的活血祛瘀中藥，研究發(fā)現(xiàn)，其具有擴張血管、改善微循環(huán)、抗炎、清除自由基等功能[2]。紅花注射液為紅花經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝分離提取制備而成，臨床上多用于心腦血管疾病和糖尿病周圍神經(jīng)炎的治療。動物研究發(fā)現(xiàn)，紅花注射液對腸IR損傷具有保護[3]，能否將紅花注射液用于周圍神經(jīng)IR損傷尚未見報道。本研究擬采用周圍神經(jīng)IR大鼠模型，初步探討紅花注射液在周圍神經(jīng)IR損傷中的保護作用及其機制，為臨床防治周圍神經(jīng)IR損傷提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

3K30型超低溫離心機（德國Sigma公司）；550型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；UV-265紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；Evomatic-8000誘發(fā)型電位儀（丹麥Dantec公司）；電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（美國PE公司）。

1.2 試藥

紅花注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號：100105，規(guī)格：5 mL/支）；20%甘露醇注射液（石家莊四藥有限公司，批號：101105235，規(guī)格：50 g∶250 mL）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯(lián)免疫法（ELIA）試劑盒購自天津康爾克生物科技有限公司。

1.3 動物

Ⅰ級純種SD大鼠，♂，體重180～200 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK（渝）20020001）。

2 方法

2.1 復(fù)制周圍神經(jīng)IR模型

參照文獻[4]復(fù)制周圍神經(jīng)IR模型。SD大鼠以4%水合氯醛ip麻醉，固定，剪開一側(cè)腹股溝部皮膚，用10 g捏持力的無損傷動脈夾阻斷髂總動脈起始處，再用2個同樣的動脈夾夾于髂內(nèi)、髂外動脈的起始處，靜脈血管不予阻斷，6 h后松開動脈夾，恢復(fù)血流。對照大鼠僅分離暴露髂總動脈、髂內(nèi)動脈和髂外動脈6 h。

2.2 分組和給藥

30只大鼠隨機分為對照（等容生理鹽水）、模型（等容生理鹽水）、甘露醇（20%，5 mL·kg-1）和紅花注射液高、中、低劑量（32、16、8 mL·kg-1）組。除對照組外，各組分別于恢復(fù)血流灌注同時尾iv相應(yīng)藥物。再灌注6 h后處死大鼠檢測各項指標。

2.3 肢體功能評估方法

參照Kinnoshitam Y等[5]的量化評估系統(tǒng)評估患肢功能，分值越高功能越差。

2.4 SOD活性檢測

分離坐骨神經(jīng)，制備10%組織勻漿，4℃下、4000 r·min-1離心20 min，保留上清液，備用。按照SOD試劑盒說明書方法測定SOD活性。

2.5 MDA含量檢測

分離坐骨神經(jīng)，制備10%組織勻漿，4℃下、4000 r·min-1離心20 min，保留上清液，備用。按照MDA試劑盒說明書測定MDA含量。

2.6 ELISA法檢測TNF-α水平

分離坐骨神經(jīng)，制備10%組織勻漿，4℃下、4000 r·min-1離心20 min，保留上清液，備用。按照ELISA試劑盒說明書方法測定TNF-α水平。

2.7 神經(jīng)電生理指標檢測

近端電極置于坐骨神經(jīng)膝上4 cm，遠端置腓總神經(jīng)膝下1 cm，接收電板置于脛骨前肌，實驗中電極位置不變。連續(xù)動態(tài)觀察運動神經(jīng)傳導速度、動作電位波幅、潛伏期的變化。再灌注5 h后，每15 min記錄1次，取其平均值。

2.8 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法檢測坐骨神經(jīng)鈣離子水平

將坐骨神經(jīng)置于1.0 mL濃硝酸，室溫消化1 h后放入65℃烤箱，4 h后加入5 mL去離子水，1500 r·min-1離心5 min。取上清液，于422.7 nm波長處檢測鈣離子水平。

2.9 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 紅花注射液對模型大鼠肢體功能評分的影響

模型組大鼠肢體功能評分較對照組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，甘露醇和紅花注射液高、中劑量組肢體功能評分顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。紅花注射液對模型大鼠肢體功能評分影響見表1。

表1 紅花注射液對模型大鼠肢體功能評分的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effect of C.tinctorius injection on limb function score of model rats（±s，n＝5）

表1 紅花注射液對模型大鼠肢體功能評分的影響（±s，n＝5）Tab 1 Effect of C.tinctorius injection on limb function score of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別對照組模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組肢體功能評分0±010.63±1.74＊7.29±1.19#11.07±1.817.54±1.24#5.52±0.90##

3.2 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)SOD和MDA的影響

與對照組比較，模型組SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，甘露醇和紅花注射液高、中劑量組SOD活性顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)SOD和MDA的影響見表2。

表2 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)SOD和MDA的影響（±s，n＝5）Tab 2 Effect of C.tinctorius injection on SOD and MDA in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

表2 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)SOD和MDA的影響（±s，n＝5）Tab 2 Effect of C.tinctorius injection on SOD and MDA in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

MDA/nmol·mg-1 12.66±2.7731.50±3.59＊23.06±2.62#29.22±3.3221.87±3.94#18.61±2.12#組別對照組模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組SOD/U·mg-1 186.41±23.68107.57±15.43＊139.31±20.17#112.48±20.32128.09±23.14#157.24±28.11##

3.3 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)TNF-α的影響

與對照組比較，模型組TNF-α顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，紅花注射液高劑量組TNF-α顯著降低（P＜0.05）。紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)TNF-α的影響見表3。

3.4 紅花注射液對模型大鼠神經(jīng)電生理的影響

與對照組比較，模型組神經(jīng)潛伏期顯著延長，神經(jīng)傳導速度和波幅顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，甘露醇和紅花注射液高劑量組神經(jīng)潛伏期顯著縮短，神經(jīng)傳導速度和波幅顯著增加（P＜0.01或P＜0.05）。紅花注射液對模型大鼠神經(jīng)電生理的影響見表4。

表3 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)TNF-α的影響（±s，n＝5）Tab 3 Effect of C.tinctorius injection on TNF-α in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

表3 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)TNF-α的影響（±s，n＝5）Tab 3 Effect of C.tinctorius injection on TNF-α in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組5.37±1.7210.54±1.41＊9.13±1.099.21±1.248.62±1.125.58±0.95#TNF-α/ng/L-1

表4 紅花注射液對模型大鼠神經(jīng)電生理的影響（±s，n＝5）Tab 4 Effect of C.tinctorius injection on neural electrophysiology of model rats（±s，n＝5）

表4 紅花注射液對模型大鼠神經(jīng)電生理的影響（±s，n＝5）Tab 4 Effect of C.tinctorius injection on neural electrophysiology of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

波幅/mV 9.76±1.641.98±0.45＊4.71±0.79#2.32±0.395.31±0.77#6.54±0.88##組別對照組模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組潛伏期/ms 1.37±0.255.15±0.76＊3.81±0.41#4.94±0.624.02±0.532.96±0.37#傳導速度/m·s-1 42.52±6.1322.14±4.29＊30.58±4.51#19.63±3.8327.72±3.7935.03±5.75##

3.5 紅花注射液對模型大鼠神經(jīng)鈣離子的影響

與對照組比較，模型組坐骨神經(jīng)鈣離子含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，甘露醇和紅花注射液高劑量組坐骨神經(jīng)鈣離子含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)鈣離子的影響見表5。

表5 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)鈣離子的影響（±s，n＝5）Tab 5 Effect of C.tinctorius injection on calcium in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

表5 紅花注射液對模型大鼠坐骨神經(jīng)鈣離子的影響（±s，n＝5）Tab 5 Effect of C.tinctorius injection on calcium in nervi ischiadicus of model rats（±s，n＝5）

與對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

鈣離子/μg·g-1 19.46±3.1681.11±10.92＊54.07±8.28#86.42±12.6361.73±9.3147.81±7.64##分組對照組模型組甘露醇組紅花注射液低劑量組紅花注射液中劑量組紅花注射液高劑量組

4 討論

周圍神經(jīng)組織由于血供豐富、耗氧量低，且能迅速適應(yīng)無氧代謝，故較少發(fā)生IR損傷。但隨著車禍傷、機械切割傷等易致肢體長時間缺血缺氧損傷發(fā)生率的不斷提高，對于周圍神經(jīng)IR損傷的防治也日益受到重視。

研究認為，周圍神經(jīng)IR主要損傷不是發(fā)生于缺血期間，而是在血液灌注恢復(fù)，氧分子重新進入組織后[6]。在正常生理條件下，由于機體有強大的自由基防御系統(tǒng)，可將產(chǎn)生的自由基及時清除。而IR時抗氧化物質(zhì)在缺血期間已被大量消耗滅活，血流恢復(fù)時自由基產(chǎn)生急劇增加，清除能力卻顯著下降，造成自由基的堆積。自由基可直接攻擊神經(jīng)髓鞘髓磷脂，造成脂質(zhì)過氧化損傷，導致髓鞘水腫，細胞膜通透性增加[7]。隨著細胞膜通透性升高，鈣離子內(nèi)流隨之升高，細胞內(nèi)出現(xiàn)鈣超載，鈣超載可進一步加重細胞內(nèi)氧化應(yīng)激失衡，形成氧化應(yīng)激失衡與鈣超載的惡性循環(huán)[8]。MDA水平可反映機體氧自由基水平，SOD則是抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的重要組成部分，通過檢測MDA和SOD水平可以初步評價機體氧化應(yīng)激平衡系統(tǒng)。此外，研究認為細胞因子也參與了周圍神經(jīng)IR的病理生理進程。在周圍神經(jīng)IR損傷部位發(fā)現(xiàn)了炎性細胞、巨噬細胞和淋巴細胞及其相關(guān)細胞因子。相關(guān)研究也顯示，在周圍神經(jīng)IR損傷部位，促炎因子TNF-α表達增加[9]。

本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠肢體功能和神經(jīng)電生理指標顯著減退，表明IR導致大鼠坐骨神經(jīng)組織機構(gòu)和功能受損。MDA、TNF-α和鈣離子水平隨之顯著升高，SOD活性顯著降低，則提示氧化應(yīng)激平衡失調(diào)、鈣超載和炎癥反應(yīng)參與了周圍神經(jīng)IR損傷，與文獻報道一致。紅花注射液和甘露醇均能降低坐骨神經(jīng)組織MDA和鈣離子含量，升高SOD活性，顯著改善大鼠肢體功能評分和神經(jīng)電生理指標。與甘露醇比較，紅花注射液還能明顯降低TNF-α濃度，表明紅花注射液抗炎作用強于甘露醇。同時實驗數(shù)據(jù)顯示，紅花注射液的上述作用具有劑量依賴性。

本研究表明，紅花注射液對周圍神經(jīng)IR損傷具有保護作用，其作用機制可能與抑制氧化應(yīng)激、抗炎和減少鈣離子內(nèi)流有關(guān)。

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