余瓊，白志川，孟德勝，盧來春，張雪梅，傅若秋#（.西南大學園藝園林學院，重慶市 40075；.第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院，重慶市 40004；.重慶醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗系，重慶市 40006）

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是引起獲得性肺炎最重要病原菌，也是引起中耳炎、腦膜炎和菌血癥的主要病原菌[1]。青霉素類藥物被認為是治療肺炎鏈球菌感染的首選藥物，但由于近年來抗生素的普遍濫用，導致肺炎鏈球菌開始對青霉素耐藥，并且對頭孢霉素、四環(huán)素和氯霉素等常見抗生素的敏感性下降[2]，因此尋找和發(fā)現(xiàn)新的抗肺炎鏈球菌藥物很有必要。從中草藥中篩選抗肺炎鏈球菌藥物，探索其抗菌物質(zhì)基礎，對新藥的開發(fā)具有深刻意義。目前在這方面的報道很少，為此，筆者對23種中草藥的水提物和醇提物進行了抗肺炎鏈球菌活性的篩選和研究。

1 材料

1.1 中藥材

甘草、黃芩、黃芪、蒲公英、桑葉、三七、白花蛇舌草、淫羊藿、皂角刺、夏枯草、半枝蓮、木瓜、仙鶴草、茵陳、大血藤、側柏葉、陳皮、葛根、菊花、枇杷葉、大薊、黨參、紫蘇藥材均由第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院中草藥房提供，經(jīng)第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院傅若秋主管藥師鑒定為真品。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

肺炎鏈球菌臨床菌株由重慶醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗系鑒定并惠贈。C+Y培養(yǎng)基（含1 mmol·L-1的CaCl2和0.2%牛血清白蛋白（BSA））由重慶醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗系配制；血瓊脂平板（CN）由重慶龐通醫(yī)療器械有限公司提供。

2 方法[3]

2.1 水提物的制備

稱取每種藥材各10 g，分別加150 mL純化水浸泡24 h。在水浴鍋中沸水浴加熱1 h，收集濾液，濾渣再加150 mL純化水繼續(xù)沸水浴加熱1 h，重復4次，合并濾液，過濾，濃縮至濃度為1∶1（按生藥材計為1 g·mL-1），用無菌純化水按倍比稀釋法稀釋至1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，共5個濃度，備用。

2.2 醇提物的制備

稱取每種藥材各10 g，用95%乙醇150 mL浸泡3次，每次7 d，過濾，合并濾液，回收乙醇，制成浸膏，用5%二甲基亞砜（DMSO）配成濃度為1∶1（按生藥材計為1 g·mL-1），再用5%二甲基酰胺（DMF）按倍比稀釋法稀釋至1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，共5個濃度，備用。

2.3 菌種的制備

將菌種接種于含C+Y培養(yǎng)基的試管中，于37℃孵箱中培養(yǎng)8 h，用培養(yǎng)基調(diào)整其吸光度（OD600）值為0.8，再用培養(yǎng)基稀釋1000倍，相當于菌液濃度為106cfu·mL-1，備用。

2.4 抑菌試驗

2.4.1 初篩 于無菌96孔板中每孔加入菌液190μL、濃度為1∶1的中藥提取物（醇提物、水提物）10μL，每種中藥提取物重復3次；另取菌液190μL、5%DMSO 10μL作為陽性菌對照孔；取培養(yǎng)基190μL、無菌純化水10μL作為陰性菌對照孔。于37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，肉眼觀察培養(yǎng)液澄清者，表明其對應的中藥提取物有抑菌作用，用于后續(xù)試驗。

2.4.2 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定 于無菌96孔板中每孔加入菌液190μL，分別加入濃度為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32初篩有效的中藥提取物10 μL，每種中藥提取物每個濃度重復3次；另取菌液190μL、5%DMF 10μL作為陽性菌對照孔；取培養(yǎng)基190μL、無菌純化水10μL作為陰性菌對照孔。于37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，肉眼觀察培養(yǎng)液澄清者所對應的最低濃度即為該中藥提取物的MIC。將肉眼觀察到的澄清培養(yǎng)液轉(zhuǎn)種至血瓊脂平板中，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察結果，血平板中無細菌生長者所對應的最低濃度即為該中藥提取物的MBC。

2.4.3 抗菌活性比較 取空白紙片，分別置于濃度為1∶1的初篩有效的中藥提取物中浸泡24 h，取出，晾干，作為中藥提取物藥敏紙片。參照常規(guī)紙片法測定其抑菌圈大小，初步比較各中藥提取物的抗菌活性。

3 結果

3.1 初篩結果

23種中草藥的醇提物和水提物中有11種對肺炎鏈球菌有抗菌活性，分別為三七、黃芩、蒲公英、淫羊藿、夏枯草、半枝蓮、側柏葉、陳皮、仙鶴草、木瓜、菊花。

3.2 MIC、MBC測定結果

三七、木瓜的醇提取和水提物均有較強的抑菌和殺菌活性，而黃芩、半枝蓮、側柏葉、仙鶴草的醇提物表現(xiàn)出了一定的殺菌作用。不同中草藥提取物對肺炎鏈球菌的MIC、MBC見表1。

3.3 抗菌活性結果比較

從抑菌圈直徑大小分析，三七、木瓜水提物和醇提物抑菌作用較強，尤以二者醇提物為最。不同中草藥提取物對肺炎鏈球菌抗菌活性測定結果見表2。

4 討論

23種中草藥中，有11種中草藥的水提物和醇提物對肺炎鏈球菌均有抑制作用，三七和木瓜的水提取和醇提物均有殺菌作用；黃芩、半枝蓮、側柏葉、仙鶴草的醇提物有殺菌作用。

由于各中草藥中所含組分、活性強度、提取收率等均不盡相同，因此其抑菌圈直徑大小并不能完全反應活性成分的抑菌強度，只能粗略比較在相同提取方法下，同等濃度（1∶1，按生藥材計）的中草藥提取物的活性大小差異。結果表明，木瓜、三七醇提物的抑菌作用最強。

表1 不同中草藥提取物對肺炎鏈球菌的MIC、MBCTab 1 MIC，MBC of Chinese herbal medicine extracts against streptococcus pneumouiae

表2 不同中草藥提取物對肺炎鏈球菌的抗菌活性測定結果Tab 2 Results of antimicrobial activity of different Chinese herbal medicine extracts on streptococcus pneumoniae

綜上所述，本研究結果可為中草藥在肺炎治療上的中藥應用提供理論依據(jù)。

[1]Hanquet G，Perrocheau A，Kissling E，et al.Surveillance of invasive pneumococcal disease in 30 EU countries：towards a european system?[J].Vaccine，2010，28（23）：3920.

[2]張 曦.204株肺炎鏈球菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].中國醫(yī)藥指南，2010，8（26）：15.

[3]齊仁立，張慧茹，崔斕斕.蒲公英抑菌成分提取工藝的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35（17）：5038.