倪 晨,王 倩,馮天保(廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣州市 510006)
腎小球硬化(Glomerular scerosis,GS)是腎小球疾病發(fā)展至終末期,腎功能衰竭的主要病理改變。其中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解減少、過(guò)度積聚,是GS的重要發(fā)病機(jī)制[1,2]。在ECM降解調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(TIMP)系統(tǒng)[3](MMPs-TIMPs),隨著TIMP-1表達(dá)增強(qiáng),MMP-9降解作用減弱,MMP-9與TIMP-1的比值失調(diào),最終形成腎小球硬化。此外,細(xì)胞因子在GS的形成過(guò)程中也起著非常關(guān)鍵的作用,其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子[4](TGF)-β1的調(diào)控作用尤為重要。TGF-β1既能促進(jìn)ECM合成增加,同時(shí)又抑制ECM的降解,最終導(dǎo)致ECM聚積,形成腎小球硬化。本研究針對(duì)上述病理機(jī)制,選取川芎、鱉甲、海藻[5~7],配伍組成川芎、川芎+鱉甲、川芎+海藻、川芎+鱉甲+海藻組,分別體現(xiàn)活血祛瘀法,活血祛瘀、散結(jié)消癥法,活血祛瘀、化痰散結(jié)法,活血祛瘀、化痰、散結(jié)消癥法等四則治法,考察祛瘀化痰、散結(jié)消癥中藥復(fù)方對(duì)ECM降解調(diào)控系統(tǒng)及TGF-β1mRNA的影響。
超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Harris公司);TE2000型倒置顯微鏡(日本Nikon公司);3000型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)BioRad公司);FA2204B型電子精密天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);7300型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司);5810(R)型冷凍離心機(jī)(德國(guó)Effendorf公司)。
川芎、鱉甲、海藻均購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定為真品;福辛普利鈉片(蒙諾,中美上海施貴寶制藥有限公司,批號(hào):H20090197),粉碎后用蒸餾水配制成0.33 g·mL-1的溶液;脂多糖(LPS)、MTT(美國(guó)Sigma公司);胎牛血清(FCS)、RPMI 1640培養(yǎng)干粉(美國(guó)Gibco公司);MMP-9酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)試劑盒、TIMP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)RB公司);First Strand cDNASynthesis Kit(加拿大Fermentas公司)。
SD大鼠70只,♀♂兼半,體重180~220 g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):粵檢證字2009A028);大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC,編號(hào):HBZY-1)由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CTCC)提供。
稱(chēng)取川芎60 g,川芎、鱉甲各30 g,鱉甲60 g,川芎、海藻各30 g,川芎、鱉甲、海藻各20 g,分別置于1000 mL圓底燒瓶中,以10倍量水回流提取2次,每次1.5 h,濾過(guò),洗滌濾渣,合并2次過(guò)濾液和洗滌液,減壓濃縮至1 g·mL-1,紫外燈滅菌1 h,即得,4℃貯藏,備用。
實(shí)驗(yàn)分為7組,即空白對(duì)照(等容蒸餾水)、LPS(等容蒸餾水),蒙諾、川芎、川芎+鱉甲、川芎+海藻和川芎+鱉甲+海藻組,ig給藥,容積為1 mL·100 g-1,每天1次,連續(xù)7 d ,7 d后取血清,備用。
取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠腎小球系膜細(xì)胞,按每1 mL 105個(gè)細(xì)胞的濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔2 mL,待細(xì)胞貼壁后,棄去培養(yǎng)液,加入不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基2 mL,饑餓24 h,達(dá)到同步化,棄去培養(yǎng)液??瞻讓?duì)照組加培養(yǎng)基2 mL,其余各組每孔加入含10 μg·mL-1LPS的完全細(xì)胞培養(yǎng)基2 mL,造成系膜細(xì)胞增值后,棄去LPS,加入相應(yīng)的各組含藥血清2 mL,置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,留取細(xì)胞上清液做ELISA檢測(cè),細(xì)胞用于熒光定量PCR檢測(cè)。
2.3.1 MMP-9的檢測(cè) 取上述各組細(xì)胞上清液,按MMP-9 ELISA試劑盒要求操作,培養(yǎng)板各孔加100 μL Assay Diluent RD1-34,每孔加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品、樣品,孵育2 h,棄去上清液,400 μL Buffer洗液,清洗4次,加MMP-9二抗孵育1 h,棄去上清液,以每孔400 μL Buffer洗液,清洗4次。每孔加顯色液200 μL,避光室溫孵育30 min,加終止液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值。
2.3.2 TIMP-1的檢測(cè) 取上述各組細(xì)胞上清液,按ELISA試劑盒要求操作,將TIMP-1 McAb分別滴加在培養(yǎng)板孔內(nèi),每孔100 μL,4℃過(guò)夜后棄去上清,用0.05%(V/V)Tween-20PBS洗板3次,每次3 min;拍干后加含15%小牛血清的PBS(PBST),每孔200 μL,4℃過(guò)夜后棄去上清液,PBST洗滌3次,每次3 min。將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品加于包被孔內(nèi),37℃孵育1 h,PBST洗板5次,拍干后每孔加HRP-抗TIMP-1二抗100 μL,37℃孵育30 min,PBST洗板5次,徹底拍干后加入TMB顯色劑,每孔50 μL,37 ℃孵育15 min,加2 mol·mL-1H2SO4每孔50 μL,終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的OD值。
2.4.1 總RNA提取 將消化好的細(xì)胞加入Trizol反復(fù)吹打裂解細(xì)胞,用氯仿、異丙醇、75%乙醇分離、純化RNA,最后用二乙基焦碳酸酯水溶解,紫外分光光度法檢測(cè)總RNA濃度及純度,置于-20℃貯藏,備用。
2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)體系為20 μL,各組分終濃度分別為dNTP 1 mmol·L-1、Oligo(dT)18 引物 2.5 nmol·L-1、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶10 IU·μL-1、總RNA樣品0.2~200 ng,DEPC水加至20 μL;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)為70℃孵育30 min,冰上放置2 min,37℃孵育5 min,42℃孵育60 min,70℃孵育10 min,所得產(chǎn)物cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。
2.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 所用的目的基因引物及內(nèi)參照GAPDH引物均委托invitrogen公司合成。引物序列:TGF-β1上游引物5′-tacagggctttcgcttcagt-3′,下游引物5′-gttggtatccagg gctctcc-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度 209 bp;GAPDH上游引物5′-ctcccattcctccacctttg-3′,下游引物 5′-ccaccaccctgttgctgtag-3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度 110 bp。反應(yīng)體系為20 μL:2 μL cDNA,1 μL SYBR Green I熒光染料,1 mmol dNTP,1 μmol·L-1上、下游引物,5 U·μL-1Taq酶,DEPC水加至20 μL,混勻。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性45 s,56℃退火45 s,72℃延伸20 s,熱循環(huán)40次,72℃延伸5 min。
2.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析方法 按照2-△△Ct相對(duì)定量方法分析,目的基因和參照基因擴(kuò)增效率都接近100%,具有一致性。ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因),ΔΔCt=ΔCt(處理組)-ΔCt(空白對(duì)照組),取100倍2-ΔΔCt數(shù)值進(jìn)行比較。
經(jīng)LPS刺激后的系膜細(xì)胞分泌MMP-9減少,TIMP-1增加(P<0.01),各中藥組均能有效上調(diào)MMP-9的表達(dá),下調(diào)TIMP-1的表達(dá),提高M(jìn)MP-9與TIMP-1的比值(P<0.01或P<0.05),其中川芎+鱉甲+海藻組效果最顯著(P<0.01)。腎小球系膜細(xì)胞MMP-9、TIMP-1的表達(dá)見(jiàn)表1。
表1 腎小球系膜細(xì)胞MMP-9、TIMP-1的表達(dá)(±s)Tab 1 The expressions of MMP-9 and TIMP-1 in mesangial cell(±s)
表1 腎小球系膜細(xì)胞MMP-9、TIMP-1的表達(dá)(±s)Tab 1 The expressions of MMP-9 and TIMP-1 in mesangial cell(±s)
與空白對(duì)照組比較:*P<0.01;與LPS組比較:#P<0.05,##P<0.01vs.blank control group:*P<0.01;vs.LPS group:#P<0.05,##P<0.01
MMP-9/TIMP-11.93±0.130.51±0.02*1.75±0.03##1.38±0.05##1.01±0.02##1.01±0.05##1.62±0.05##組別空白對(duì)照組LPS組蒙諾組川芎組川芎+鱉甲組川芎+海藻組川芎+鱉甲+海藻組n 10101010101010 MMP-9/μg·L-1 24.02±1.809.47±0.65*22.14±1.74##18.26±1.70##15.25±0.52##16.85±1.87##20.59±1.76##TIMP-1/μg·L-1 12.54±1.7018.46±0.87*12.62±0.32##13.28±1.63##15.06±0.62##16.75±1.81#12.74±1.51##
3.2.1 熔解曲線分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行熔解曲線分析。結(jié)果表明,無(wú)外源性的污染或者引物二聚體的存在,說(shuō)明本研究設(shè)計(jì)的引物是特異性的,且退火溫度合適。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)熔解曲線見(jiàn)圖1;GAPDH熒光動(dòng)力增長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。3.2.2 各中藥組對(duì)ECM相關(guān)調(diào)控細(xì)胞因子TGF-β1mRNA表達(dá)的影響 LPS刺激促進(jìn)TGF-β1mRNA水平升高(P<0.01);各中藥組均能抑制LPS刺激后系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)(P<0.01);其中以川芎+鱉甲+海藻組效果最顯著。腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)見(jiàn)表2;TGF-β1熔解曲線見(jiàn)圖3;TGF-β1熒光動(dòng)力增長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4。
圖1 GAPDH熔解曲線Fig 1 GAPDH melting curve
圖2 GAPDH熒光動(dòng)力增長(zhǎng)曲線Fig 2 GAPDH fluorescence dynamic growth curve
表2 腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)(±s)Tab 2 The expressions of TGF-β1mRNA in mesangial cells(±s)
表2 腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)(±s)Tab 2 The expressions of TGF-β1mRNA in mesangial cells(±s)
與空白對(duì)照組比較:*P<0.01;與LPS組比較:#P<0.01vs.blank control group:*P<0.01;vs.LPS group:#P<0.01
組別空白對(duì)照組LPS組蒙諾組川芎組川芎+鱉甲組川芎+海藻組川芎+鱉甲+海藻組n 2-△△CT 5.89±1.42*2.03±1.36#2.89±1.33#3.12±1.71#3.19±1.46#2.17±1.41#101010101010101
圖3 TGF-β1熔解曲線Fig 3 TGF-β1melting curve
中國(guó)古代醫(yī)籍中沒(méi)有“GS”的表述,但根據(jù)其發(fā)展過(guò)程中的臨床表現(xiàn)與發(fā)病特點(diǎn),該病可歸屬于水腫、虛勞、腎勞、癃閉等證范疇。該證絡(luò)氣郁滯[8],瘀血痰濕凝滯腎絡(luò)而致腎絡(luò)癥積,腎臟組織的病理改變,如ECM積聚、血管拌閉塞、球囊粘連、局灶或節(jié)段性GS等,都可歸屬于“腎絡(luò)癥積”的范疇。
圖4 TGF-β1熒光動(dòng)力增長(zhǎng)曲線Fig 4 TGF-β1fluorescence dynamic growth curve
筆者通過(guò)川芎、鱉甲、海藻相互配伍,針對(duì)腎絡(luò)之“痰、瘀、癥積”,在祛瘀、化痰的同時(shí),配伍散結(jié)消癥之品以增強(qiáng)消癥化積之力,以期痰瘀同治、癥結(jié)并消。結(jié)果提示,該復(fù)方能抑制LPS刺激條件下腎小球系膜細(xì)胞TIMP-1的表達(dá)(P<0.01),從而減少對(duì)MMP-9活性的阻斷,使ECM積聚減少;同時(shí)下調(diào)體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)(P<0.01),抑制ECM的合成。腎絡(luò)癥積理論指導(dǎo)下的祛瘀化痰、散結(jié)消癥中藥復(fù)方,可為中醫(yī)藥臨床治療GS提供新的思路,但仍需進(jìn)一步研究。
[1]Klahr S,Morrissey JI.The role of vasoactive compounds growth factors and cytokines in the progression of renal diease[J].Kidney Int Suppl,2000,7(5):57.
[2]彭 爽,曹文富.中藥防治腎纖維化的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2010,21(7):666.
[3]雷鳳英,覃遠(yuǎn)漢,裴 娟,等.基質(zhì)金屬蛋白酶及金屬蛋白酶組織抑制因子-1在腎小球硬化大鼠中的表達(dá)和意義[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2007,22(23):1812.
[4]Ostendorf T,Kunter U,van Roeyen C,et al.The effects of platelet-derived growth factor antagonism in experimental glomerulo-nephritis are independent of the transforming growth factor-beta system[J].J Am Soc Nephrology,2002,13(3):658.
[5]杜 聯(lián),殷麗平,楊 彥,等.川芎嗪聯(lián)合貝那普利對(duì)GK大鼠腎間質(zhì)MCP-1和TGF-β1表達(dá)干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,32(5):479.
[6]范煥芳,陳志強(qiáng).鱉甲煎丸對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響[J].中成藥,2007,29(2):183.
[7]薄守波,鞠建偉,李建遠(yuǎn),等.褐藻多糖硫酸酯對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞增殖及纖連蛋白與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子分泌的影響[J].中華腎臟病雜志,2006,22(10):638.
[8]王永鈞,張敏鷗.痰瘀互結(jié)與腎內(nèi)微型癥積[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2003,4(1):1.