彭健，羅禮云，李鐵，梅嘯，牛云茜，龔五星

由于對(duì)冠心病的藥物和血運(yùn)重建治療的進(jìn)展，使許多患者得到及時(shí)治療，死亡率顯著降低，但冠心病患者通常存在嚴(yán)重的左心室功能不全，在疾病后期發(fā)生慢性心力衰竭(心衰)的病例數(shù)增多，且以老年人常見，慢性心衰在很大程度上可以說是老年病。然冠心病患者發(fā)生慢性心衰的原因迄今尚未完全闡明，近年來，遺傳因素在慢性心衰發(fā)生發(fā)展中的地位和作用已逐漸受到關(guān)注，慢性心衰與腎素—血管緊張素系統(tǒng)基因多態(tài)性間關(guān)系的研究已成為其病因?qū)W研究的一個(gè)熱點(diǎn)［1，2］。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和血管緊張素原(AGT)是腎素—血管緊張素系統(tǒng)中的兩個(gè)關(guān)鍵成分，本研究通過檢測(cè)ACE和AGT基因多態(tài)性在中國南方部分漢族人群老年冠心病患者中的分布，以探討兩基因多態(tài)性在老年冠心病患者發(fā)生慢性心衰中的作用和意義。

1 對(duì)象和方法

研究對(duì)象:2004-04至2009-12在我院及珠海市人民醫(yī)院、珠海市第二人民醫(yī)院住院的老年冠心病患者共396例，平均年齡為69.5±7.1(60～91)歲。所有患者均經(jīng)冠狀動(dòng)脈(冠脈)造影檢查，冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn):左冠脈主干、左前降支、左回旋支及右冠脈中至少一支血管狹窄≥50%。396例患者分為病例組:冠心病合并慢性心衰者196例(其中合并高血壓者60例)，男性128例，女性68例，平均年齡(70.0±8.3)歲。慢性心衰診斷參照修改的Framingham標(biāo)準(zhǔn):紐約心功能(NYHA)分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)、超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左心室射血分?jǐn)?shù)＜0.45，慢性心衰病史至少≥3個(gè)月。對(duì)照組:沒有合并慢性心衰(心功能正常)者200例(其中合并高血壓者74例)，男性132例，女性68例，平均年齡(69.0±6.4)歲。兩組患者的臨床一般資料如年齡、性別構(gòu)成、既往曾發(fā)生心肌梗死的例次、病程、吸煙率、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。排除標(biāo)準(zhǔn):①嚴(yán)重肝、腎功能不全;②嚴(yán)重的急性感染或代謝紊亂;③急性心衰;④2周內(nèi)未行血運(yùn)重建的急性心肌梗死者;⑤合并心瓣膜疾病者。本研究對(duì)象間無血緣關(guān)系，均為中國南方漢族人。

研究方法:調(diào)查所有研究對(duì)象的吸煙、高血壓、糖尿病及高血脂史，測(cè)量身高、體重，檢測(cè)空腹血糖及血脂、血紅蛋白、肝功能、腎功能。

人基因組脫氧核糖核酸(DNA)的提取:抽取外周靜脈血5ml，2%依地酸抗凝，低滲法分離白細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞裂解液及蛋白酶K消化，酚/氯仿/異戊醇方法提取基因組DNA，無水乙醇沉淀，保存于TE緩沖溶液中。

ACE基因插入/缺失(I/D)多態(tài)性引物序列及檢測(cè):具體方法參見文獻(xiàn)［3］。

AGT基因M235T多態(tài)性引物序列及檢測(cè):具體方法參見文獻(xiàn)［4］。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，基因型分布及等位基因頻率比較用χ2檢驗(yàn)。基因型及等位基因相對(duì)危險(xiǎn)度以優(yōu)勢(shì)比(OR)及其95%置信區(qū)間(CI)表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。均應(yīng)用SPSS15.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

兩組患者血生化資料的比較:兩組患者血生化如血紅蛋白、空腹血糖、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酶比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅病例組血肌酐(95.6±48.9)μmol/L高于對(duì)照組(79.8±31.3)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Hardy-Weinberg平衡檢測(cè):本組資料中，對(duì)照組ACE及AGT基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2分別為1.22和0.02，P＞0.05)，表明該群體為遺傳平衡群體，本研究資料具有群體代表性。

兩組ACE基因多態(tài)性分布:由表1可見，病例組DD基因型頻率顯著高于對(duì)照組(81.9%vs 43.6%，χ2=17.470，P ＜0.01)，與同組II、ID 型相比，DD 型者發(fā)生慢性心衰的優(yōu)勢(shì)比為2.476(95%置信區(qū)間:1.611～3.806)。同時(shí)，D等位基因頻率也較對(duì)照組顯著增高(64.3%vs 43.5%，χ2=17.206，P ＜0.01)。

表1 兩組患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性分布［%(例)］

兩組患者AGT基因M235T多態(tài)性分布:由表2可見，病例組TT基因型頻率高于對(duì)照組(65.3%vs 48.0%，χ2=12.067，P ＜0.01)，與同組mm、MT 型相比，TT型冠心病患者發(fā)生慢性心衰的優(yōu)勢(shì)比為2.039(95%置信區(qū)間:1.361～3.055)。同時(shí)，T等位基因頻率也較對(duì)照組高(79.1%vs 69.5%，χ2=4.752，P＜0.05)。

表2 兩組患者血管緊張素原基因M235T多態(tài)性分布［%(例)］

兩組ACE基因I/D及AGT基因M235T多態(tài)性分布的聯(lián)合分析:病例組及對(duì)照組中同時(shí)具有ACE基因DD型及AGT基因TT型的頻率分別為28.6%和15.0%，前者高于后者(χ2=5.362，P=0.021)。與其他基因型組合(表3)相比，具有DD+TT聯(lián)合基因型的老年冠心病患者發(fā)生慢性心衰的優(yōu)勢(shì)比為2.627(95%置信區(qū)間:1.123～4.575)。而與非DD非TT型組合(表3)相比，具有DD+TT聯(lián)合基因型的患者發(fā)生慢性心衰的優(yōu)勢(shì)比為4.225(95%置信區(qū)間:1.847～9.664)。

表3 兩組患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因插入/缺失及血管緊張素原基因M235T多態(tài)性分布的聯(lián)合分析(%)

非條件Logistic回歸分析慢性心衰易患因素和易患因素的交互作用:以ACE基因型(x1)、AGT基因型(x2)、性別(x3)、年齡(x4)、病程(x5)、既往曾發(fā)生心肌梗死的例次(x6)、吸煙史(x7)、收縮壓(x8)及舒張壓(x9)、總膽固醇(x10)、低密度脂蛋白膽固醇(x11)、血紅蛋白(x12)、空腹血糖(x13)、血肌酐(x14)為自變量，并定義 x1、x2、x3、x7為分類變量，以是否發(fā)生慢性心衰為因變量，用Forward:Ward法建立非條件Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果表明，ACE基因型與老年冠心病患者發(fā)生慢性心衰相關(guān)(P＜0.05)，而AGT基因型、病程、血壓等其他因素被剔除(表4)。進(jìn)一步以ACE基因型和AGT基因型(x1)、性別(x2)、病程(x3)、既往曾發(fā)生心肌梗死的例次(x4)、吸煙史(x5)、收縮壓(x6)及舒張壓(x7)、總膽固醇(x8)、低密度脂蛋白膽固醇(x9)、血紅蛋白(x10)、空腹血糖(x11)、血肌酐(x12)為自變量，用同種方法建立回歸模型，分析老年冠心病患者慢性心衰易患因素和易患因素的交互作用，結(jié)果表明，DD+TT、DI+TT基因型、血紅蛋白、肌酐參與慢性心衰發(fā)生的概率(P＜0.05)，其他因素被剔除。以II+MM型為參照，DD+TT基因型發(fā)病的優(yōu)勢(shì)比為3.579(95%置信區(qū)間:1.521～8.418，P ＜0.01)。表4

表4 Logistic回歸分析老年冠心病患者慢性心力衰竭易患因素和易患因素的交互作用

3 討論

冠心病導(dǎo)致心肌供血與能量代謝障礙，進(jìn)一步可使心肌舒縮性能原發(fā)性降低，但不同的冠心病患者在臨床表型及預(yù)后等方面存在著顯著的差別，部分患者發(fā)生慢性心衰的時(shí)間明顯較其他患者早，且預(yù)后較差。除已知的危險(xiǎn)與干預(yù)因素影響外，個(gè)體基因的不同與變異可能在慢性心衰的發(fā)生與發(fā)展及治療轉(zhuǎn)歸等方面起不容忽視的重要作用［1，5］。近年來ACE基因I/D多態(tài)性與心血管疾病遺傳易感性及臨床表現(xiàn)的關(guān)系成為臨床及流行病學(xué)研究的熱點(diǎn)。有證據(jù)表明DD型ACE基因可能會(huì)增加心肌梗死后左心室肥厚的風(fēng)險(xiǎn)［6］，攜帶DD基因型及D等位基因的冠心病患者發(fā)生慢性心衰的幾率明顯增加，而且該基因型可作為心功能惡化程度的一個(gè)標(biāo)志［7］。本研究以老年冠心病患者為研究對(duì)象，其中合并慢性心衰者的DD基因型頻率及D等位基因頻率明顯高于心功能正常者，提示ACE基因I/D多態(tài)性與中國南方部分漢族人群老年冠心病患者發(fā)生慢性心衰有關(guān)，DD型ACE基因及D等位基因可能是該地區(qū)老年冠心病患者慢性心衰發(fā)病的遺傳危險(xiǎn)因素。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，體內(nèi)ACE水平主要由遺傳因素決定，47%的血清ACE水平受其影響，DD基因型的血清ACE水平最高［8］。慢性心衰患者的ACE基因表達(dá)較正常人明顯增強(qiáng)，心臟局部組織ACE水平亦與D等位基因呈顯著正相關(guān)［9］。ACE的主要作用是催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，后者可通過其受體刺激心肌細(xì)胞肥大和成纖維細(xì)胞增殖并使兩者的表型改變，從而最終導(dǎo)致心肌重構(gòu)和心功能惡化。腎素—血管緊張素系統(tǒng)中的另一關(guān)鍵成分AGT基因M235T多態(tài)性被認(rèn)為與較高的血漿血管緊張素原水平、高血壓及左心室肥厚相關(guān)［10］。最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，攜帶TT型AGT基因的高血壓患者發(fā)生慢性心衰的危險(xiǎn)性增加，且發(fā)病年齡較其他基因型者早約十年［11，12］。但該基因多態(tài)性與冠心病患者發(fā)生慢性心衰的關(guān)聯(lián)性資料尚缺乏研究，我們初次探討了AGT基因多態(tài)性在老年冠心病患者發(fā)生慢性心衰中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型及T等位基因的老年冠心病患者發(fā)生慢性心衰的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。由于TT基因型者的血漿及心肌組織細(xì)胞中AGT水平更高，而AGT濃度的微小變化即可影響到血管緊張素Ⅱ的生成量，故推測(cè)AGT基因M235T多態(tài)性是通過AGT、血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌激活而加快心肌重構(gòu)進(jìn)程，使老年冠心病患者發(fā)生慢性心衰的幾率增加。

鑒于慢性心衰是多基因疾病，僅分析單個(gè)基因獲得的信息量較少，結(jié)果不甚可靠。宜選擇多個(gè)候選基因客觀地從不同側(cè)面分析，既需探討某一基因多態(tài)性的作用，更需要對(duì)不同候選基因之間的相互作用進(jìn)行分析。本研究聯(lián)合分析了ACE基因I/D和AGT基因M235T基因多態(tài)性與老年冠心病患者發(fā)生慢性心衰的關(guān)系，結(jié)果表明老年冠心病合并慢性心衰組ACEDD+AGT-TT基因型頻率明顯高于對(duì)照組，進(jìn)一步應(yīng)用Logistic回歸分析慢性心衰的易患因素發(fā)現(xiàn)，ACE和AGT基因在冠心病患者慢性心衰的發(fā)生中具有協(xié)同作用，以Ⅱ+MM型為參照，DD+TT基因型發(fā)病的優(yōu)勢(shì)比為3.579，高于ACE-DD型單基因發(fā)生慢性心衰的優(yōu)勢(shì)比(2.721)及AGT-TT型單基因發(fā)生慢性心衰的優(yōu)勢(shì)比(2.039)，DD型基因的老年冠心病患者若同時(shí)攜帶有TT基因，發(fā)生慢性心衰的幾率明顯增高。

我們前期對(duì)不同病因心衰的總體研究表明，腎素—血管緊張素系統(tǒng)基因多態(tài)性與慢性心衰的發(fā)生及病情嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)，DD-ACE基因型是慢性心衰發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且攜帶DD基因型的慢性心衰患者病情更加嚴(yán)重［13］，但AGT M235T多態(tài)性似與慢性心衰的發(fā)生無關(guān)?？紤]到年齡構(gòu)成在基因多態(tài)性分析中的重要性，本研究則在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步聯(lián)合分析了老年冠心病患者發(fā)生慢性心衰與ACE基因I/D及AGT基因M235T雙位點(diǎn)基因多態(tài)性的關(guān)系，得到的研究結(jié)果為我們的觀點(diǎn)增添了新的實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。慢性心衰是心臟病學(xué)領(lǐng)域最后有待攻破的堡壘，深入研究其遺傳病學(xué)特征，不僅可篩查出慢性心衰高?；颊?，盡早干預(yù)防治其病情進(jìn)展，更重要的是最終達(dá)到根據(jù)每個(gè)患者的遺傳多態(tài)性狀況合理用藥，真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。

［1］梅嘯，彭健.腎素—血管緊張素系統(tǒng)多態(tài)性與慢性心力衰竭關(guān)系的研究進(jìn)展.中國心血管病研究雜志，2005，3:76-79.

［2］Wu CK.A propensity score-based case-control study of renin-angiotensin system gene polymorphisms and diastolic heart failure.Atherosclerosis，2009，205(2):497-502.

［3］Rigat B，Hubert C，Corvol P，et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene(DCP1)(dipeptidyl carboxypeptidase 1).Nucleic Acids Res，1992，20:1433.

［4］Russ AP，Maerz W，Ruzicka V，et al.Rapid detection of the hypertension associated Met 235--＞Thr allele of the human angiotensinogen gene.Hum Mol Genet，1993，2:609-610.

［5］羅禮云，彭健.腎素—血管緊張素系統(tǒng)及交感神經(jīng)系統(tǒng)基因多態(tài)性與慢性心力衰竭個(gè)體化治療.國際心血管病雜志，2007，34:125-127.

［6］Karaali ZE，Agachan B，Yilmaz H，et al.Angiotensin-converting enzyme I/D gene polymorphisms and effects of left ventricular hypertrophy in Turkish myocardial infarction patients.Acta Cardiol，2004，59:493-497.

［7］No authors listed.Association of polymorphic markers I/D of gene ACE and A1166C of gene AT2R1 with ischemic chronic heart failure in the Russian and Tatar populations of Bashkortostan Republic.Genetika，2006，42:1712-1717.

［8］Payne JR，Dhamrait SS，Gohlke P.The impact of ACE genotype on serum ACE activity in a black South African male population.Ann Hum Genet，2007，71:1-7.

［9］Davis GK，Millner RW，Roberts DH.Angiotensin converting enzyme(ACE)gene expression in the human left ventricle:effect of ACE gene insertion/deletion polymorphism and left ventricular function.Eur J Heart Fail，2000，2:253-256.

［10］Sethi AA，Nordestgaard BG，Tybjaerg-Hansen A.Angiotensinogen gene polymorphism，plasma angiotensinogen，and risk of hypertension and ischemic heart disease:a meta-analysis.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23:1269-1275.

［11］Pilbrow AP，Palmer BR，F(xiàn)ramptoncm，et al.Angiotensinogen M235T and T174M gene polymorphisms in combination doubles the risk of mortality in heart failure.Hypertension，2007，49:322-327.

［12］Zakrzewski-Jakubiak M，de Denus S，Dubé MP，et al.Ten renin-angiotensin system-related gene polymorphisms in maximally treated Canadian Caucasian patients with heart failure.Br J Clin Pharmacol，2008，65(5):742-751.

［13］彭健，梅嘯，彭澍，等.腎素—血管緊張素系統(tǒng)多態(tài)性與慢性心力衰竭的關(guān)系.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2006，27:405-409.