謝小玉 尹永根 福田直也

（1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716；2筑波大學(xué)大學(xué)院生命環(huán)境科學(xué)研究科基因研究中心，日本 筑波 305-8572）

蔗糖是植物體內(nèi)碳水化合物長距離轉(zhuǎn)運(yùn)的主要（甚至唯一）形式，其在成熟葉片中合成后，進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)到多種異養(yǎng)組織中，是影響整個(gè)植物生產(chǎn)能力和作物產(chǎn)量的重要因素（戚繼艷 等，2007）。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（sucrose transporter，SUT）負(fù)責(zé)蔗糖的跨膜運(yùn)輸，在韌皮部介導(dǎo)的源—庫蔗糖運(yùn)輸以及庫組織的蔗糖供給中起關(guān)鍵作用（Kammerer et al.，1998；Nguyen-Quoc & Foyer，2001；Fridman et al.，2004）。根據(jù)近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一個(gè)多成員的基因家族，根據(jù)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的不同特性，分別歸類為SUT1、SUT2/SUC3和SUT43個(gè)亞族，SUT1是高親和質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白載體，與韌皮部蔗糖的裝載/卸載、庫細(xì)胞的分化和發(fā)育有關(guān)（楊彩菊 等，2006）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的相對定量方法能直觀地得到處理及未處理樣品間表達(dá)量差異倍數(shù)。與早期定量PCR方法即擴(kuò)增產(chǎn)物在跑膠后通過染料、放射活性或探針定量檢測、手工收集數(shù)據(jù)等繁瑣工序相比，增強(qiáng)了常規(guī)定量分析（魏敏 等，2006）。

研究表明，品種和栽培措施〔摘葉程度、摘葉方法、栽培密度、營養(yǎng)液電導(dǎo)率（EC）值〕影響番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)、積累，進(jìn)而影響番茄的產(chǎn)量（渡部申也，2010）；在番茄綠果中主要是SUT1的表達(dá)影響到番茄果實(shí)的發(fā)育（Hackel et al.，2006）。本試驗(yàn)通過SYBR Green染料實(shí)時(shí)PCR，以Ubqutin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，采用相對定量方法，數(shù)字化表示在不同栽培措施下不同品種的番茄綠果和葉片中SUT1基因的表達(dá)差異，研究不同栽培措施誘導(dǎo)SUT1基因在不同品種間表達(dá)的差異性，探索不同栽培措施下不同品種產(chǎn)量差異的原因，同時(shí)為闡明番茄蔗糖供給與調(diào)控的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在日本筑波大學(xué)農(nóng)林生物中心的G5溫室中栽培，試驗(yàn)布置如圖1。采用營養(yǎng)液膜技術(shù)，連續(xù)流動供液，營養(yǎng)液配方為大塚〔大量元素（mg·L-1）∶NO3-N 16.6、P 5.1、NH4-N 1.6、K 8.6、Ca 8.2、Mg 3.0，微量元素（mg·L-1）：MnCl2·4H2O 1.81、HBO32.86、ZnSO4·7H2O 0.22、CuSO4·5H2O 0.08、Na2MoO4·2H2O 0.025〕。選用兩個(gè)番茄品種，分別為麗容（來自于日本）、萊邦索（來自于荷蘭）。摘葉程度為1/2摘葉、1/3摘葉；摘葉方法為均一摘葉、從下至上的下位摘葉（圖2）；營養(yǎng)液EC值為1.8 dS·m-1和3.0 dS·m-1；栽植密度設(shè)兩個(gè)，高密度（H）為60000株·hm-2，株距為11 cm，低密度（L）為20000株·hm-2，株距為33 cm。番茄種子經(jīng)浸泡催芽后播在營養(yǎng)缽中，50 d的苗齡定植于栽培槽中，槽寬20 cm，槽間距80 cm。

圖1 試驗(yàn)田間種植圖

圖2 摘葉處理示意圖

分兩茬栽培分析，第一茬為早熟栽培（2009年3～8月）、第二茬為促成栽培（2009年8月～2010年2月），試驗(yàn)數(shù)據(jù)來自于促成栽培。每處理區(qū)栽種9株，在中間7株中隨機(jī)選取4株取樣。于第2穗果直徑2～4 cm時(shí)取直徑3 cm左右的果實(shí)、果柄及第2穗果下葉片的頂部小葉，液氮速凍，-80 ℃保存。在果實(shí)變紅時(shí)分期分批收獲稱質(zhì)量。

1.2 RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR

總RNA的提取采用RNeasy plant Mini kit（QIAGEN，Valencia，CA，USA），提取方法參照試劑盒說明書。提取的總RNA溶解在RNase free-water中，貯藏在-80 ℃用于cDNA的合成。cDNA的合成采用First Strand cDNA Synthesis kit（TAKARA BIO Inc.，Otsu Japan），合成方法參照試劑盒使用說明。

qRT-PCR 的引物按照 Amplify ver.3.1.4（B.Engels，University of Wisconsin，USA；http：//engels.genetics wisc.edu/amplify）設(shè)計(jì)，SUT1的引物為 Re primer：TAC AGT TTC GCA TCA CCG AC；Fw Primer：AAC TCC CGG AGA AAG AAG AG。內(nèi)標(biāo)基因?yàn)?Ubquitin，其引物為 Fw primer：CCC TGG CTG ATT ACA ACA TC；Re primer：TGG TGT CAG TGG GTT CAA TG。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃30 s，1個(gè)循環(huán)；反應(yīng)儀器為Mx3000p qRT-PCR system（Stratagene，San Diego，CA，USA）。

采用Takara公司的SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）試劑盒，10 μL反應(yīng)體系中包含 SYBR ROX 0.3 μL，Master Mix 5 μL，F(xiàn)w Primer 1 μL，Re primer 1 μL，cDNA 2.7 μL。每個(gè)樣品做3次平行反應(yīng)。基因表達(dá)差異的分析方法采用Pfaffl（2001）的方法。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理番茄產(chǎn)量

由圖 3、4可看出，番茄的單株產(chǎn)量不論是麗容還是萊邦索都表現(xiàn)出低密度栽培高于高密度栽培，而單位面積的產(chǎn)量表現(xiàn)出低密度栽培低于高密度栽培；在同一栽培措施下不論是單株產(chǎn)量還是單位面積產(chǎn)量都表現(xiàn)出麗容低于萊邦索。

圖3 不同處理下番茄單株產(chǎn)量

2.2 不同器官的SUT1基因表達(dá)情況

按照SUT1相對表達(dá)量的公式計(jì)算，以無摘葉低密度栽培的麗容葉片中SUT1基因表達(dá)量為參照因子，設(shè)為1，得到不同栽培措施不同品種的SUT1基因表達(dá)量（圖5）。由圖5可看出，果實(shí)中的SUT1表達(dá)量低于果柄和葉片。在不同處理下，葉片中SUT1的表達(dá)量與單株產(chǎn)量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.983。

圖4 不同處理下番茄單位面積產(chǎn)量

圖5 不同栽培措施不同品種的SUT1基因表達(dá)量

2.3 營養(yǎng)液EC值、品種和栽培密度對SUT1在不同器官中表達(dá)量的影響

由表1可看出，在葉片中，EC值為1.8 dS·m-1時(shí)，麗容在高密度栽培下SUT1的表達(dá)量最高，萊邦索在低密度栽培下SUT1的表達(dá)量次之，而在EC值為3.0 dS·m-1時(shí)，麗容在高密度栽培下SUT1的表達(dá)量最低，表明麗容葉片轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖的能力低，而且已適應(yīng)了長期高密度的栽培條件。麗容對EC值的適應(yīng)能力較萊邦索低，高濃度的EC值使麗容的SUT1表達(dá)量大大下降，對蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降。

果柄中，在高密度栽培下EC值為1.8 dS·m-1時(shí)麗容的SUT1的表達(dá)量最高，低密度栽培下EC值為3.0 dS·m-1時(shí)次之，但差異不顯著（表1）。果柄雖也是光合器官，但不是光合主要器官，因此雖然SUT1的表達(dá)量高，但運(yùn)輸?shù)恼崽强偭坎淮?，對果?shí)的蔗糖貢獻(xiàn)很有限。

表1 營養(yǎng)液EC值、品種和栽培密度對SUT1在不同器官中表達(dá)量的影響

果實(shí)中，EC值為1.8 dS·m-1時(shí)麗容高密度栽培SUT1的表達(dá)量最高，EC值為3.0 dS·m-1時(shí)麗容高密度栽培SUT1的表達(dá)量次之，而萊邦索不管是在何種EC值和栽培密度下SUT1的表達(dá)量都較低（表1）。表明麗容由葉片轉(zhuǎn)運(yùn)到果實(shí)中的蔗糖可能還被轉(zhuǎn)運(yùn)到種子或其他幼嫩器官中，如花芽、生長點(diǎn)等（Smeekens，2000），而萊邦索由葉片轉(zhuǎn)運(yùn)到果實(shí)中的蔗糖易于貯藏（萊邦索葉片中SUT1表達(dá)量較高，表明葉片合成的蔗糖易于向貯藏器官轉(zhuǎn)運(yùn)，而果實(shí)中SUT1表達(dá)量較低，表明蔗糖不易向其他器官轉(zhuǎn)運(yùn)而貯藏下來），這可能是萊邦索較麗容產(chǎn)量高的一個(gè)重要原因。

2.4 摘葉、品種、栽培密度對SUT1表達(dá)量的影響

表2表明，在麗容葉片中，無摘葉、高密度栽培下SUT1表達(dá)量最高，1/3摘葉和低密度栽培下SUT1表達(dá)量次之，但與萊邦索1/3摘葉、高密度下SUT1表達(dá)量無顯著差異，而萊邦索1/3摘葉低密度栽培下 SUT1表達(dá)量最低；果柄的變化與葉片差異不大；而果實(shí)中表現(xiàn)出麗容的 SUT1表達(dá)量均大于萊邦索，這表明麗容由葉片和果柄轉(zhuǎn)運(yùn)到果實(shí)中的蔗糖可能還被轉(zhuǎn)運(yùn)到種子或其他的幼嫩器官，而萊邦索由葉片轉(zhuǎn)運(yùn)到果實(shí)中的蔗糖易于貯藏。

表2 摘葉、品種、栽培密度對SUT1表達(dá)量的影響

2.5 不同摘葉方式對番茄SUT1表達(dá)量的影響

表3表明，摘葉程度、摘葉方法對不同品種番茄SUT1表達(dá)量的影響不論是在葉片、果柄還是果實(shí)中都呈極顯著差異。葉片中，萊邦索1/3均一摘葉的SUT1表達(dá)量最大，麗容1/3均一摘葉的次之，萊邦索1/2下葉摘葉的最??；果柄中均一摘葉的SUT1表達(dá)量大多高于下葉摘葉，而果實(shí)中除1/2下葉摘葉外，其余表現(xiàn)出麗容的SUT1的表達(dá)量高于萊邦索，1/2摘葉大多高于1/3摘葉。說明1/3摘葉比1/2摘葉更有利于蔗糖在產(chǎn)品器官的累積。

表3 摘葉程度、摘葉方法對不同品種番茄SUT1表達(dá)量的影響

2.6 單因素對SUT1表達(dá)量的影響

通過進(jìn)一步分析，得到單因素對SUT1表達(dá)量的影響（圖6）。由圖6可以看出，不管是在番茄的葉、果實(shí)還是果柄中，營養(yǎng)液中的EC值1.8 dS·m-1時(shí)SUT1的表達(dá)量都高于EC值3.0 dS·m-1；高密度栽培的SUT1表達(dá)量大于低密度栽培；均一摘葉大于下葉摘葉；而1/3摘葉與1/2摘葉之間在葉片中差異達(dá)極顯著水平，在果柄和果實(shí)中差異不顯著。麗容的SUT1表達(dá)量在果實(shí)和果柄中都大于萊邦索，而在葉片中表達(dá)量小于萊邦索。表明番茄開花坐果期促進(jìn)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)的適宜營養(yǎng)液EC值不能太高，否則產(chǎn)生鹽害，抑制蔗糖的運(yùn)轉(zhuǎn)。而品種的特性也是影響蔗糖運(yùn)轉(zhuǎn)的重要因素，葉片中萊邦索的SUT1表達(dá)量高，表明萊邦索的葉片制造的蔗糖向果實(shí)運(yùn)轉(zhuǎn)的速率高，而果實(shí)和果柄中SUT1的表達(dá)量低，表明果實(shí)和果柄中合成和貯藏的蔗糖不易于向其他器官運(yùn)輸，便于貯存，致使萊邦索的果實(shí)產(chǎn)量大于麗容。此外在適當(dāng)高的栽培密度下，蔗糖的運(yùn)轉(zhuǎn)速率會更高。

圖6 單因素對番茄葉片、果柄、果實(shí)SUT1表達(dá)量的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)選擇番茄的葉、果實(shí)和果柄采用 qRT-PCR技術(shù)分析可知，不論是葉片、果柄還是果實(shí)，品種、摘葉方式、摘葉量、營養(yǎng)液的EC值都影響到番茄SUT1基因的表達(dá)，無摘葉＞1/3摘葉＞1/2摘葉、均一摘葉﹥下葉摘葉、營養(yǎng)液EC值1.8 dS·m-1時(shí)﹥EC值3.0 dS·m-1時(shí)；而品種對SUT1表達(dá)量的影響比較復(fù)雜，葉片中萊邦索﹥麗容，而果柄和果實(shí)中反之。葉片中SUT1的表達(dá)量與番茄的單株產(chǎn)量成呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.983。

植物SUT1基因在植物光合產(chǎn)物（蔗糖）的轉(zhuǎn)運(yùn)與分配上起關(guān)鍵作用。SUT1是葉片中的主要蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，一般在葉（源）中高度表達(dá)，參與蔗糖往韌皮部裝載及在植株體內(nèi)的長距離運(yùn)輸活動（Chincinska et al.，2008）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，葉片和果柄中SUT1的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于果實(shí)，蔗糖向果實(shí)的裝載增強(qiáng)，促進(jìn)蔗糖從源（葉和果柄）向果實(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)。這與前人的結(jié)論相同。

SUT1對底物蔗糖的高親和性特點(diǎn)還表明，它對胞內(nèi)外蔗糖濃度的變化非常敏感，可受蔗糖、晝夜節(jié)律、鹽漬、植物生長物質(zhì)、光和 ATP等調(diào)控。Matsukura等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，光照可以增強(qiáng)蔗糖對水稻 OsSUT1的誘導(dǎo)表達(dá)作用。本試驗(yàn)進(jìn)行了早熟栽培和促成栽培番茄 SUT1表達(dá)量的研究，所得結(jié)果有些差異，其主要原因可能也是由于光照強(qiáng)度、光周期的影響。光照對番茄SUT1表達(dá)量的影響還有待于進(jìn)一步深入研究。

渡部申也.2010.栽培密度和摘葉處理對番茄同化產(chǎn)物分配的影響〔碩士論文〕.筑波：筑波大學(xué).

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