劉和鳳，何家才，樊 麗（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，合肥市 230032）

司帕沙星是第4代氟喹諾酮類藥物，對(duì)革蘭陰性菌、陽(yáng)性菌及厭氧菌具有廣譜抗菌作用，具有口服吸收好、組織分布廣、生物利用度高、消除半衰期長(zhǎng)等藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)[1]。1993年首先在日本上市，繼而在法國(guó)、英國(guó)、比利時(shí)、芬蘭及瑞士等國(guó)家注冊(cè)。我國(guó)現(xiàn)已有多種劑型上市，主要以片劑和膠囊劑為主，臨床廣泛應(yīng)用于治療下呼吸道感染、肺結(jié)核、慢性前列腺炎、宮頸炎、口腔感染、根管的沖洗消毒等，其臨床療效及安全性已得到證實(shí)。本試驗(yàn)的目的是研究健康志愿者口服3種司帕沙星制劑后的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)并評(píng)價(jià)其生物等效性，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp溶劑輸送泵、SPD-10Avp紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、Chromato-Solution Light色譜中文數(shù)據(jù)系統(tǒng)（日本島津公司）；TDL80-2B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SZ-1型快速混勻器（江蘇金壇市金成國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；AL104/01型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

受試制劑1:司帕沙星膠囊（江蘇萬(wàn)高藥業(yè)有限公司，規(guī)格:每粒100 mg，批號(hào):080911）；受試制劑2:司帕沙星片（江蘇萬(wàn)高藥業(yè)有限公司，規(guī)格:每片100 mg，批號(hào):080915）；參比制劑:司帕沙星膠囊（鄭州永和制藥有限公司，規(guī)格:每粒100 mg，批號(hào):060301）；司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)品:（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):130461-200501，含量:99.8%）；內(nèi)標(biāo):加替沙星標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):130518-200402，含量:99.4%）；三乙胺、甲醇、乙腈為色譜純，冰醋酸為分析純，水為純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Shim-packVP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:醋酸緩沖液（冰醋酸-水（5∶95），用三乙胺調(diào)pH至2.87）∶乙腈＝80∶20；流速:1.0 mL·min－1；柱溫:26 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):298 nm；靈敏度:0.005AUFS；進(jìn)樣量:20 μL。在該色譜條件下，司帕沙星和內(nèi)標(biāo)加替沙星分離良好，不受血漿色譜峰的干擾，內(nèi)標(biāo)加替沙星和司帕沙星的保留時(shí)間分別約為4.7 min和5.6 min。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液+內(nèi)標(biāo)溶液；C.空白血漿+司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液+內(nèi)標(biāo)溶液；D.受試者服藥4 h后血漿+內(nèi)標(biāo)溶液；1.加替沙星；2.司帕沙星Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.sparfloxacin standard solution+internal standard；C.blank plasma+sparfloxacin standard solution+internal standard；D.plasma 4 h after administration+internal standard；1.gatifloxacin；2.sparfloxacin

2.2 受試者選擇

選擇24名男性健康志愿者，年齡19～25歲，平均年齡（22.38±1.60）歲，平均體重（61.13±5.33）kg，體重指數(shù)20～24。受試前經(jīng)病史詢問(wèn)、體格檢查及血、大小便常規(guī)檢查均正常，無(wú)藥物過(guò)敏史，無(wú)煙、酒嗜好，本品皮試陰性，試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)過(guò)程中未服用其他任何藥物。受試者試驗(yàn)前均簽署知情同意書(shū)，且本試驗(yàn)方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

2.3 試驗(yàn)方案

采用3制劑3周期雙重3×3拉丁方交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。將24名志愿者隨機(jī)分成A、B、C 3組，分別服用受試制劑和參比制劑。受試者于前一日晚餐后，禁食禁水12 h，次日清晨在前臂靜脈安置留置針，抽取空白血樣（服藥前0 h）3 mL后，用200 mL溫開(kāi)水送服（3種制劑的服用量均為400 mg），分別于服藥后0.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0 h時(shí)各采血3 mL，血標(biāo)本收集于肝素抗凝管內(nèi)，室溫靜置后離心分離血漿，血漿樣本置－20℃低溫冰箱，避光保存?zhèn)錅y(cè)。服藥后2 h可飲水，4 h和10 h進(jìn)統(tǒng)一清淡飲食。洗脫期2周，清洗期密切觀察受試者的一般情況，2周后交叉服藥，連服藥3周期。試驗(yàn)期間由醫(yī)護(hù)人員監(jiān)護(hù)。

2.4 血漿樣品的處理

精密量取血漿200 μL置1.5 mL具塞試管中，精密加入內(nèi)標(biāo)（29 μg·mL－1加替沙星）溶液10 μL混勻，精密加入甲醇300 μL，于快速混勻器上混合2 min沉淀蛋白，靜置10 min后，置于高速冷凍離心機(jī)以12000 r·min－1離心10 min，取出上清液于另一試管中再以12000 r·min－1離心10 min，取第2次離心后上清液20 μL直接進(jìn)樣分析，以內(nèi)標(biāo)法定量。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及最低檢測(cè)濃度

精密吸取不同濃度的司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)貯備液10 μL，置1.5 mL具塞試管中，加入空白血漿200 μL，配制成每毫升血漿含待測(cè)物司帕沙星分別為0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本，按“2.4”項(xiàng)下自“精密加入內(nèi)標(biāo)（29 μg·mL－1加替沙星）溶液10 μL”起同法操作，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。以待測(cè)物司帕沙星濃度（X）為橫坐標(biāo)，司帕沙星色譜峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)加替沙星色譜峰面積（Ai）的比值（Y）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（1/X2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝－0.004+0.774X（r＝0.9990，n＝7）。結(jié)果表明，司帕沙星血藥濃度在0.0625～4.0 μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測(cè)濃度（最低定量下限）為0.0625 μg·mL－1（S/N＞10）。

2.6 回收率及精密度試驗(yàn)

取1.5 mL具塞試管，分別精密加入不同濃度的司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL及空白血漿200 μL，配制成低、中、高3種濃度（0.125、1.0、4.0 μg·mL－1）血漿樣品各3份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣20 μL，得到司帕沙星與內(nèi)標(biāo)加替沙星峰面積之比值A(chǔ)s（H）/Ai（H）；另取1.5 mL具塞試管，分別精密加入不同濃度的司帕沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)加替沙星的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置低、中、高相同濃度的對(duì)照品溶液各3份，進(jìn)樣20 μL，得到司帕沙星與內(nèi)標(biāo)加替沙星峰面積之比值A(chǔ)s（D）/Ai（D）。按公式[As（H）/Ai（H）]/[As（D）/Ai（D）]×100%計(jì)算提取回收率，結(jié)果低、中、高3種濃度的回收率分別為69.99%、96.35%、71.54%；RSD分別為4.60%、4.54%、3.09%。另配制低、中、高3種濃度（0.125、1.0、4.0 μg·mL－1）的血漿樣品各0.5 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，在不同天內(nèi)連續(xù)制備并測(cè)定3批，每批樣品測(cè)定3個(gè)濃度，每個(gè)濃度5份樣品，計(jì)算日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）。結(jié)果日內(nèi)和日間的RSD均＜15%，表明方法的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制低、中、高3種濃度（0.125、1.0、4.0 μg·mL－1）的血漿樣品，每個(gè)濃度各4份，一份立即按“2.4”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定血漿中藥物濃度；第2份室溫放置24 h后，同法測(cè)定血漿中藥物濃度，考察血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；第3份于－20℃保存7 d后，自然解凍后，同法測(cè)定血漿中的藥物濃度，考察樣品在冷凍條件下的穩(wěn)定性；第4份反復(fù)凍融3次后，同法測(cè)定血漿中藥物濃度，考察樣品在凍融條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果4份樣品的RSD均＜15%，表明血漿樣品在室溫放置、冷凍儲(chǔ)存及反復(fù)凍融情況下穩(wěn)定。

2.8 藥-時(shí)曲線

24名受試者口服司帕沙星受試制劑1、2和參比制劑后的平均藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 健康受試者單劑量口服3種司帕沙星制劑400 mg后平均藥-時(shí)曲線Fig 2 Mean concentration-time curves of sparfloxacin in healthy volunteers after receiving single dose of 3 kinds of sparfloxacin preparations 400 mg

2.9 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

24名受試者口服司帕沙星受試制劑1、2和參比制劑后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

2.10 生物等效性分析

分別對(duì) 2 種受試制劑與參比制劑的 cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞進(jìn)行方差分析和雙向單側(cè)t檢驗(yàn)，受試制劑1、2與參比制劑的cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞相比均無(wú)顯著性差異，故2種受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

表1 健康受試者單劑量口服3種司帕沙星制劑400 mg后主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of sparfloxacin in healthy volunteers after receiving single dose of 3 kinds of sparfloxacin preparations 400 mg

3 討論

本試驗(yàn)24名志愿者全部是醫(yī)學(xué)院學(xué)生，平均體重（61.13±5.33）kg，平均年齡（22.38±1.60）kg，全部完成試驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程由醫(yī)師和護(hù)士進(jìn)行觀察，24名受試者服藥后均未見(jiàn)不良事件的發(fā)生。

樣品測(cè)定過(guò)程中為減少系統(tǒng)誤差，筆者每天建立1條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度，并測(cè)定低、中、高（0.125、1、4 μg·mL－1）質(zhì)控樣品3種濃度，確保計(jì)算得到的藥物濃度準(zhǔn)確可靠。

本試驗(yàn)血漿樣品的處理與文獻(xiàn)[2，3]報(bào)道不同，直接加入色譜甲醇沉淀蛋白，操作方便，適合大批量的血漿樣品檢測(cè)。流動(dòng)相（醋酸緩沖液（冰醋酸-水（5∶95），用三乙胺調(diào)pH值至2.87）∶乙腈＝80∶20）、柱溫（26 ℃）與文獻(xiàn)[2，3]報(bào)道也不同[2，3]。預(yù)試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道血漿樣品的處理方法復(fù)雜，需加乙腈，再水浴和氮?dú)獯蹈桑晃墨I(xiàn)所用的流動(dòng)相與柱溫靈敏度也較低，專屬性不高。流動(dòng)相篩選發(fā)現(xiàn)采用醋酸緩沖液（冰醋酸-水（5∶95），用三乙胺調(diào)pH值至2.87）∶乙腈＝80∶20時(shí)，內(nèi)標(biāo)和試藥峰形最好，出峰時(shí)間適宜。

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是利用DAS2.0.1統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù):t1/2、cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞。其中cmax和tmax均以實(shí)測(cè)值表示，AUC用梯形法計(jì)算，t1/2＝0.693/λz，λz為末端消除常數(shù)（用對(duì)數(shù)藥-時(shí)曲線末段直線部分斜率求得），相對(duì)生物利用度F＝AUC受試制劑/AUC參比制劑×100%。

分別對(duì) 2 種受試制劑和參比制劑的 cmax、tmax、AUC0～t、AUC0～∞等進(jìn)行方差分析和雙單側(cè)t檢驗(yàn)，并進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)。分析受試制劑和參比制劑之間、個(gè)體間和周期間變異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

cmax、AUC0～t、AUC0～∞在進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)和（1－2α）置信區(qū)間考察。AUC在參比制劑的80%～125%作為等效標(biāo)準(zhǔn)，cmax在參比制劑的70%～143%作為等效標(biāo)準(zhǔn)。

受試制劑司帕沙星膠囊、司帕沙星片和參比制劑司帕沙星膠囊相比，在相對(duì)生物利用度、吸收程度、達(dá)峰時(shí)間上均具有生物等效性。

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