王曉杰，陳 榮（江蘇常州市第一人民醫(yī)院，常州市 213003）

糖皮質(zhì)激素是最早使用的預(yù)防和治療腎移植排斥反應(yīng)的藥物。從20世紀(jì)20－80年代，應(yīng)用于腎移植的免疫抑制劑有了很大的發(fā)展，但激素作為基本藥物一直是不可替代的。目前糖皮質(zhì)激素的給藥多依據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，而忽略不同患者之間的藥動學(xué)的差異。內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的變化可作為腎移植排斥反應(yīng)的診斷及判斷排斥反應(yīng)對糖皮質(zhì)激素沖擊治療是否敏感的指標(biāo)[1]。為此，筆者建立了測定腎移植患者血清中內(nèi)源性氫化可的松濃度的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)，包括2996紫外檢測器、1525雙泵、717自動進(jìn)樣器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；BT25S電子分析天平（德國塞多利斯公司，精密度:1×10－5g）；KTC-16H高速臺式離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；低溫冰箱（日本Sanyo公司）；渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

可的松對照品（美國Sigma公司，含量:98%，批號:2007117）；氫化可的松對照品（美國Sigma公司，含量:98%，批號:035K1291）；內(nèi)標(biāo):苯巴比妥對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:171222-200303）；甲醇、乙腈為色譜純，水為雙重蒸餾去離子水，其他試劑均為分析純。小牛血清（杭州四季青生物公司，批號:050516）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:迪馬Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈-水-甲醇（51∶136∶77）；流速 :1.2mL·min－1；檢測波長:245 nm；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:30μL。該色譜條件下，血清中的雜質(zhì)不影響氫化可的松的測定。氫化可的松及內(nèi)標(biāo)苯巴比妥的峰保留時(shí)間分別為12.2min和7.0min。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.小牛血清+內(nèi)標(biāo)；B.健康者血清+氫化可的松對照品+可的松對照品；C.健康者血清+內(nèi)標(biāo)；D.腎移植患者血清+內(nèi)標(biāo)；1.苯巴比妥；2.可的松；3.氫化可的松Fig 1 HPLC chromatogramsA.bovine calf serum spiked with internal standard；B.human serum spiked with cortisol and cortisol；C.human serum spiked with internal standard；D.kidney-transplant recipients serum spiked with internal standard；1.phenobarbital；2.cortisone；3.cortisol

2.2 血清樣品的處理

取血清500μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液（50mg·L－1苯巴比妥）10μL和乙酸乙酯3mL，渦旋混合器振蕩1min后，4500 r·min－1離心15min，取上清液于尖底試管中，60℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)眉状?0μL溶解，進(jìn)樣30μL。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及最低檢測限

取小牛血清[2]500μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液（50mg·L－1苯巴比妥）10μL，再加入125μg·mL－1氫化可的松對照品溶液，使其濃度分別為50、100、150、200、250、300μg·L－1，按照“2.2”項(xiàng)下方法處理，測定樣品及內(nèi)標(biāo)的峰面積，以氫化可的松血藥濃度（X）為橫坐標(biāo)，氫化可的松與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（Y，其中氫化可的松與內(nèi)標(biāo)的峰面積比要減去小牛血清在氫化可的松處微小峰與內(nèi)標(biāo)的峰面積比）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為:Y＝0.1455X+0.01666（r＝0.9994）。結(jié)果表明，氫化可的松血藥濃度在50～300μg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，根據(jù)信噪比（S/N）≥3計(jì)算氫化可的松的最低檢測限為8μg·L－1。

2.4 回收率試驗(yàn)

配制低、中、高3種不同濃度（75、175、275μg·L－1）的氫化可的松血清樣品各3份，按照“2.2”項(xiàng)下方法處理，記錄峰面積，同時(shí)以相同量對照品溶液直接進(jìn)樣的峰面積為對照，計(jì)算提取回收率。結(jié)果低、中、高3種濃度的提取回收率分別為（80.12±2.3）%、（79.77±3.5）% 、（75.48±4.5）%，3種濃度的提取回收率均＞70%。另測定樣品及內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算其峰面積比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對應(yīng)濃度，計(jì)算低、中、高3種濃度的方法回收率分別為（103.12±4.53）%、（100.77±4.07）% 、（101.61±6.92）%。

2.5 精密度試驗(yàn)

配制低、中、高3種不同濃度氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)血清各5份，按照“2.2”項(xiàng)下方法測定樣品及內(nèi)標(biāo)的峰面積，考察其日內(nèi)及日間精密度，結(jié)果見表1。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制低、中、高3種不同濃度的氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)血清各5份，置－38℃冰箱中保存。按照“2.5”項(xiàng)下方法操作，在2周內(nèi)完成穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果3種濃度RSD均＜10%，提示樣品可于－38℃冰箱保存至少2周。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（，n＝5）Tab 1 Results of precision tests（ ，n＝5）

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（，n＝5）Tab 1 Results of precision tests（ ，n＝5）

加入量/μg·L-1 75175275日內(nèi)實(shí)測值/μg·L-1 77.34±3.39176.35±7.12279.43±19.04日內(nèi)RSD/%4.394.046.81日間實(shí)測值/μg·L-1 77.13±7.06173.79±7.11280.27±14.26日間RSD/%9.164.095.09

2.7 腎移植患者血清中氫化可的松濃度測定

腎移植隨訪患者年齡17～62歲，平均41.6歲，術(shù)后腎功能穩(wěn)定。腎移植術(shù)后均用環(huán)孢素A（CsA）+霉酚酸酯（MMF）+潑尼松三聯(lián)用藥，所有受檢者于上午8∶00－8∶30時(shí)靜脈采血2mL進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示各組術(shù)后3個(gè)月以上腎移植患者內(nèi)源性氫化可的松濃度逐漸穩(wěn)定。腎移植患者氫化可的松水平檢測結(jié)果見表2。

表2 腎移植患者氫化可的松水平檢測結(jié)果（）Tab 2 Concentrations of cortisol in patients underwent kidney transplantation（ ）

表2 腎移植患者氫化可的松水平檢測結(jié)果（）Tab 2 Concentrations of cortisol in patients underwent kidney transplantation（ ）

內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素腎移植患者氫化可的松濃度/μg·L-1 1～3個(gè)月（38例）31.89±21.423～6個(gè)月（30例）45.26±29.266～12個(gè)月（44例）49.69±22.00＞12個(gè)月（52例）53.56±29.86

3 討論

根據(jù)受體調(diào)節(jié)的下調(diào)（Downregulation）原則，血漿皮質(zhì)醇濃度降低，淋巴細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體水平增高，而淋巴細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體水平增高的患者對外源性激素治療敏感[3]，提示內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的測定可能對排斥反應(yīng)的診斷有幫助。器官移植中糖皮質(zhì)激素在免疫及抗排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制，以及其對全身的影響還缺少深刻的認(rèn)識，明顯落后于其他免疫移植藥物的研究。本組數(shù)據(jù)顯示腎移植術(shù)后腎功能穩(wěn)定患者內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素水平隨移植時(shí)間逐漸升高，術(shù)后3個(gè)月，患者的內(nèi)源性氫化可的松濃度逐漸趨于穩(wěn)定，平均為（52.15±25.58）μg·L－1，與文獻(xiàn)結(jié)果基本一致[4]。排斥患者數(shù)據(jù)是否存在差異則有待進(jìn)一步探討。

本法的建立及腎移植術(shù)后內(nèi)源性氫化可的松濃度的測定，為進(jìn)一步研究及指導(dǎo)臨床使用糖皮質(zhì)激素提供了理論依據(jù)。

[1]羅志剛，唐孝達(dá)，楊宇如，等.腎移植排斥反應(yīng)時(shí)血糖皮質(zhì)激素監(jiān)測的意義[J].中華器官移植雜志，2001，22（3）:158.

[2]秦永平，余 勤，羅志剛.高效液相色譜法同時(shí)測定血清中氫化潑尼松和氫化可的松[J].藥物分析雜志，1995，15（4）:9.

[3]Morineau G，Boudi A，Barka A，et al.Radioimmunoassay of cortisone in serum，urine，and saliva to assess the status of the cortisol-cortisone shuttle[J].Clin Chem，1997，43（8 Pt 1）:1397.

[4]Oka K，Hirano T，Shimodaira H，et al.Suppression of endogenous cortisol for evaluating pharmacodynamics of prednisolone in early allograft rejection in renal transplantation[J].Clin Chem，1990，36（3）:481.