宋曉勇，張永州，吳先闖，王云香，呂維玲，楊磊（.河南大學淮河醫(yī)院，開封市 475000；2.河南大學藥學院，開封市 475000）

環(huán)孢素A（CsA）是臨床上常用的免疫抑制劑，主要用于預防器官或組織移植所發(fā)生的排斥反應及重型再生障礙性貧血。因其有效血藥濃度范圍窄、患者個體差異大[1]，因此對臨床應用的CsA進行血藥濃度監(jiān)測可有效地提高療效并減少毒副反應的發(fā)生[2]。目前，臨床上測定CsA血藥濃度的方法有免疫法和高效液相色譜（HPLC）法。酶放大免疫法（EMIT）是一種均相酶免疫分析技術，檢測原理是樣本中的藥物與用酶標記的藥物競爭抗體結合位點，與抗體結合后，酶的活性降低，可以根據(jù)酶的活性來確定樣本中待測物的濃度。該法樣品前處理簡便，自動化程度高，測定周期短，樣本量大。本試驗收集本院服用CsA的腎移植患者穩(wěn)態(tài)谷濃度血樣20份，分別用HPLC法和EMIT法進行測定，考察2種不同測定方法的區(qū)別和相關性。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A高效液相色譜儀（日本島津公司）；美國Vival_E臨床化學分析系統(tǒng)（荷蘭Vital Scientific N.V.公司制造，美國Dade Behring公司銷售）；XH-2000-I型渦旋混合器（天津醫(yī)療器械廠）；LD5-2A型高速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；電熱水浴箱（北京醫(yī)療設備廠）。

1.2 試藥

CsA對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:130495-200202，純度:99.5%）；內(nèi)標:環(huán)孢素D（CsD）對照品（福建生物藥品檢驗所，批號:0104006-416，純度:99.0%）；EMIT法測定試劑:Emit 2000 CsA前處理液（批號:6R719UL-C1）、Emit 2000 CsA定標液（批號:6R119UL-C2）、Emit 2000 CsA檢測試劑（批號:6R079UL-C2）、Emit 2000CsA質(zhì)控（批號:7190）均購自美國Dade Behring公司（麗珠試劑公司銷售）；乙腈、甲醇為色譜純，乙醚、正庚烷、正己烷為分析純；純凈水由本醫(yī)院血液透析科制備。

2 方法

2.1 樣本收集

收集我院2010年8月－2011年2月服用CsA的腎移植患者血樣20份。將分離的血漿分成2份，一份樣本用HPLC法測定，另一份樣本用EMIT法測定。

2.2 HPLC法[3]

2.2.1 色譜條件:色譜柱為Kromasil C18（250mm×4.6mm，5 μm），流動相為乙腈-甲醇-水（1600∶300∶150），紫外檢測波長為210 nm，柱溫70 ℃，流速為0.8mL·min－1，進樣量為25μL。

2.2.2 原理:用系列濃度CsA和內(nèi)標CsD的峰高比及對應的CsA濃度作標準曲線，把所測樣品與內(nèi)標的峰高比代入該曲線即得CsA濃度。

2.2.3 血樣處理:空白血樣0.4mL+標準液（血樣0.5mL加（CsD）100μL，渦旋混勻）0.1mL+250mmol·L－1氫氧化鈉（NaOH）150μL，渦旋混勻后置于45～50 ℃水浴孵育5min（破壞紅細胞），再混勻，加乙醚3mL，渦旋提取8min，3000 r·min－1離心5min。分離有機層轉(zhuǎn)入尖底試管，于45～50℃水浴通氣吹干，加入甲醇-水（7∶3）300μL溶解，用正庚烷-正己烷（1∶1）1.5mL反復萃取2次，1500 r·min－1離心5min，然后吸棄上層液，下層液于45～50℃水浴通氣吹干，殘渣用甲醇-水（7∶3）50μL充分溶解，進樣25μL進行檢測。

2.2.4 色譜圖:取空白血樣、空白血樣+CsA對照品+內(nèi)標處理后進樣25μL測定，記錄色譜。色譜詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血樣；B.空白血樣+CsA對照品+內(nèi)標；1.CsA；2.CsDFig 1 HPLC chromatogramsA.blank blood sample；B.blank blood sample+CsA+internal standard；1.CsA；2.CsD

由圖1可知，CsA和CsD（內(nèi)標）色譜保留時間分別為5.68、6.47min，且色譜峰與全血中的內(nèi)源性雜峰分離良好，易準確定量。

2.2.5 方法學驗證:將CsA和CsD的峰高比（Y）對應的CsA濃度（X）作線性回歸，得回歸方程為Y＝0.0013X－0.0083（r＝0.9997）。結果表明，CsA血藥濃度在50～1600 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關系良好。另用不同濃度的CsA加空白血樣配制成100、400、800 ng·mL－1系列濃度的血樣，按“2.2.3”項下方法處理，進行日內(nèi)、日間精密度和回收率測定。結果，日內(nèi)RSD（n＝5）分別為4.1%、3.0%、1.2%，日間 RSD（n＝5）分別為4.0%、3.1%、2.0%，回收率分別為98.2%、99.5%、100.4%。

2.3 EMIT法

2.3.1 樣本測定:按照美國Dade Behring公司Vival_E臨床化學分析系統(tǒng)的標準操作規(guī)范及試劑使用說明，用Emit 2000 CsA相應試劑盒處理樣本并進行檢測。每批次測定樣本時需對質(zhì)控品進行平行測定。

2.3.2 精密度及準確度:分別取低、中、高濃度的CsA質(zhì)控品，分別于同日和不同日測定日內(nèi)、日間RSD并考察其準確度。結果，日內(nèi)、日間RSD均在5%以內(nèi)，回收率也在90%～110%之間，見表1。

表1 EMIT法測得的CsA精密度和準確度試驗結果（，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision test of CsA concentration determined by EMIT（ ，n＝5）

表1 EMIT法測得的CsA精密度和準確度試驗結果（，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision test of CsA concentration determined by EMIT（ ，n＝5）

濃度/ng·mL-1 75350650回收率/%99.89±2.81100.41±1.84100.47±1.35日內(nèi)精密度測得量/ng·mL-1 74.92±2.11351.42±6.43653.06±8.76 RSD/%2.821.831.34日間精密度測得量/ng·mL-1 74.26±2.72348.10±9.08645.62±12.21 RSD/%3.662.611.89

2.4 數(shù)據(jù)分析

分別用EMIT法和HPLC法測定血漿中CsA濃度。樣本的正態(tài)性檢驗采用Kolmogorov-Smirnov法。如符合正態(tài)分布，則用配對t檢驗比較2組樣本均數(shù)有無差異，Deming回歸法比較2種測定方法的相關性；反之則用Wilcoxon配對檢驗和Passing-Bablok回歸法進行分析[4]。同時繪制EMIT法和HPLC法測定的散點圖和Bland-Altman偏差圖。數(shù)據(jù)分析采用MedCalc軟件（Version 11.5.1，www.medcalc.be）。

3 結果

Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗結果表明，2種方法測定血漿中CsA濃度結果均呈正態(tài)分布。配對t檢驗顯示2種方法測得的CsA血藥濃度有顯著性差異（P＜0.05）。散點圖和Bland-Altman偏差圖見圖2（橫坐標為EMIT法和HPLC法測定同一樣本濃度均值（ng·mL－1）；縱坐標為EMIT法和HPLC法測定同一樣本濃度之差（ng·mL－1）；Mean為EMIT法和HPLC法測定同一樣本濃度之差的均值）。EMIT法和HPLC法測得的血漿CsA濃度的回歸和相關性分析結果見表2。

圖2 EMIT法和HPLC法測得的人血漿CsA濃度的散點圖和Bland-Altman偏差圖A.散點圖；B.Bland-Altman偏差圖Fig 2 Scatterplots and Bland-Altman of CsA concentration determined by EMIT vs.HPLCA.scatterplots；B.Bland-Altman

表2 EMIT法和HPLC法測得人血漿CsA濃度的回歸和相關性分析結果Tab 2 Regression and correlation analysis of CsA concentration determined by EMIT vs.HPLC

由表2可知，EMIT法和HPLC法測定血漿中CsA濃度的相關方程為:Y＝－10.468+1.216X（r＝0.9940）。Bland-Altman偏差圖說明EMIT法測定血漿中CsA濃度較HPLC法高26.4 ng·mL－1，95% 可信區(qū)間為（－2.8～55.6）ng·mL－1。

4 討論

比較2種分析方法時，研究方法主要有回歸法和圖解法。本研究采用Passing-Bablok回歸和Bland-Altman偏差圖法比較EMIT法和HPLC法結果，雖然EMIT法在測定CsA的血藥濃度時與HPLC法結果差異有統(tǒng)計學意義，EMIT法測定結果高于HPLC法，但是把2種方法測定的結果進行回歸分析，獲得2組測定值之間的換算公式:cHPLC＝－10.468+1.216cEMIT（r＝0.9940），具有較好的相關性。此換算公式僅限于了解在已知濃度點上2種方法結果間的差異，以幫助臨床上判斷結果間的關系，而不能將HPLC法測定值換算成EMIT法測定值在EMIT的參考范圍內(nèi)進行臨床應用；相反，應將其結果放入特有的參考值進行臨床評價。

EMIT法是利用抗原抗體相互識別并結合來產(chǎn)生檢測信號，當某些抗原具有與待測藥物相同的抗原表面標志或者抗體有著多個抗原結合位點時，可導致抗體與那些化學結構相近于母體的代謝產(chǎn)物、樣本中的內(nèi)源性物質(zhì)產(chǎn)生交叉反應，所以這也可能是其測得結果高于HPLC法所得結果的原因。

[1]陳江華.免疫抑制劑在腎移植中的應用進展[J].實用醫(yī)院臨床雜志，2008，5（4）:11.

[2]孫增先，邢曉東.環(huán)孢素A治療藥物監(jiān)測研究進展[J].中國藥房，2010，21（10）:932.

[3]宋曉勇，張永州，王云香.HPLC法與熒光偏振免疫法檢測血樣中環(huán)孢素A濃度的比較研究[J].中國藥房，2007，18（23）:1788.

[4]焦 正，張 明，仲龍瑾，等.兩種單克隆抗體熒光免疫偏振法測定人全血中環(huán)孢素濃度的比較[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2006，26（7）:790.