周莉華，涂瓊，梅步云（.江西省人民醫(yī)院，南昌市 330006；2.江西省兒童醫(yī)院，南昌市 330006）

丙戊酸鈉（VPA）是治療癲癇的常用藥，其有效血藥濃度為50～100μg·mL－1。當(dāng)其血藥濃度＞100μg·mL－1時(shí)毒副作用增加而療效無明顯增加，常見不良反應(yīng)有惡心、嘔吐、肥胖、脫發(fā)、血小板減少和肝功能損害。其體內(nèi)過程和療效個(gè)體差異較大，導(dǎo)致劑量與血藥濃度之間相關(guān)性較差[1]，為最大限度地發(fā)揮療效和避免不良反應(yīng)，對(duì)其血藥濃度實(shí)施監(jiān)測(cè)已為臨床重視。本試驗(yàn)建立了以2-溴-對(duì)硝基苯乙酮為柱前衍生試劑，環(huán)己烷羧酸為內(nèi)標(biāo)，測(cè)定人血清中丙戊酸鈉濃度的高效液相色譜法，方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于丙戊酸鈉的血藥濃度監(jiān)測(cè)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀，包括SPD-10A紫外檢測(cè)器、CLASS-VP色譜工作站（日本島津公司）；80-2離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；SB2200超聲清洗器（美國(guó)Branson公司）；FZQ-2型渦旋振蕩器（江蘇泰縣醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

丙戊酸鈉對(duì)照品（湖南湘中制藥有限公司，純度＞99.5%，批號(hào):050821）；內(nèi)標(biāo):環(huán)己烷羧酸（美國(guó)Sigma公司，批號(hào):S15382-105）；柱前衍生化試劑:2-溴-對(duì)硝基苯乙酮（美國(guó)Sigma公司，批號(hào):S18662-045）；甲醇、三乙胺、乙腈、正己烷均為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Shimpack C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（80∶20），流速:0.9mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng):265 nm；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:20μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 丙戊酸鈉對(duì)照品溶液:準(zhǔn)確稱取丙戊酸鈉對(duì)照品25.3mg，置于5mL容量瓶中，加純化水溶解至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液:準(zhǔn)確稱取環(huán)己烷羧酸20mg，至于50mL容量瓶中，用0.5 mol·L－1氨水溶液溶解至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 柱前衍生化試劑溶液:準(zhǔn)確稱取2-溴-對(duì)硝基苯乙酮5mg至10mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解至刻度。

2.3 血樣處理

取血清0.1mL，加純化水0.1mL、內(nèi)標(biāo)溶液50μL，以3 mol·L－1硫酸0.1mL混勻，加正己烷2mL，渦旋振蕩5min，于4000 r·min－1離心5min，精密吸取上清液1mL，加2-溴-對(duì)硝基苯乙酮50μL、三乙胺10μL，于50 ℃水浴中衍生10min，用氮?dú)獯蹈桑?.1mL流動(dòng)相溶解，取20μL進(jìn)樣。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取空白血清加內(nèi)標(biāo)溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣20μL，得色譜圖1A；將一定濃度的丙戊酸鈉對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血清中，同法操作，得色譜圖1B；取患兒口服給藥后的血清樣品，同法操作，得色譜圖1C。結(jié)果表明，血清中丙戊酸鈉和內(nèi)標(biāo)環(huán)己烷羧酸分離完全，無雜質(zhì)峰干擾，本方法具有較高的特異性，準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性好，靈敏度較高。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血清+內(nèi)標(biāo)溶液；B.空白血清+丙戊酸鈉對(duì)照品溶液+內(nèi)標(biāo)；C.血清樣品；1.環(huán)己烷羧酸；2.丙戊酸鈉Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank serum+internal standard；B.blank serum+sodium valproate control+internal standard；C.serum sample；1.cyclohexanecarboxylic acid；2.sodium valproate

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取健康人的空白血清0.1mL 6份，分別加入純化水0.1mL、內(nèi)標(biāo)溶液50μL，再分別精密吸取丙戊酸鈉對(duì)照品溶液適量，使之成為含丙戊酸鈉濃度為10、20、50、75、100、150mg·L－1的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，混勻，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定分析，記錄色譜。以丙戊酸鈉的質(zhì)量濃度（Y）為縱坐標(biāo)，丙戊酸鈉與內(nèi)標(biāo)的峰面積比（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝106.8833X－3.153（r＝0.9997，n＝6），結(jié)果表明，丙戊酸鈉血藥濃度在10～150mg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以信噪比（S/N）＝3計(jì)，丙戊酸鈉最低檢測(cè)限為1mg·L－1。

2.6 精密度試驗(yàn)

取低、中、高（10、50、100mg·L－1）3種濃度血樣，分別依法測(cè)定5份，每日測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定3 d，得日內(nèi)RSD分別為3.50%、4.35%、4.60%，日間RSD分別為33.23%、2.56%、2.61%。

2.7 回收率試驗(yàn)

2.7.1 萃取回收率:分別配制濃度為10、50、75、100mg·L－1的血漿樣品，不加內(nèi)標(biāo)，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，待揮干溶劑后，以流動(dòng)相0.1mL溶解，進(jìn)樣分析，得藥物峰面積A0；另用甲醇配制成相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液，加3 mol·L－1硫酸0.1mL混勻，加2-溴-對(duì)硝基苯乙酮50μL、三乙胺10μL，于50 ℃水浴中衍生10min，用氮?dú)獯蹈?，?.1mL流動(dòng)相溶解，取20μL進(jìn)樣得藥物峰面積A1，按回收率（%）＝A0/A1×100%計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（n＝3）

2.7.2 方法回收率:以空白血清配制含丙戊酸鈉分別為10、50 、75、100mg·L－14種質(zhì)量濃度的樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，計(jì)算方法回收率，結(jié)果見表1。

2.8 干擾試驗(yàn)

考慮到臨床檢測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究的干擾情況，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，對(duì)通常配伍的藥物如苯巴比妥、卡馬西平、拉莫三嗪等進(jìn)行分析，結(jié)果苯巴比妥、卡馬西平、拉莫三嗪等在上述色譜條件下均不出峰，以上藥物對(duì)本法測(cè)定無干擾。另對(duì)江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科患者120份血樣測(cè)定，也未見合用藥物的干擾。120例患者血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果見表2。

表2 120例患者血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果Tab 2 Results of serum concentration in 120 cases

3 討論

以甲醇-水（75∶25）為流動(dòng)相，三乙胺用乙腈稀釋成含三乙胺為0.2%作催化劑，結(jié)果顯示溶劑峰太高，樣品峰太小[2]；而以甲醇-水（80∶20）為流動(dòng)相，三乙胺為催化劑，環(huán)己烷羧酸和丙戊酸鈉峰形較好，分離完全。有文獻(xiàn)報(bào)道流動(dòng)相為甲醇-水（72∶23），波長(zhǎng)為262 nm，柱溫為25 ℃，流速為1.0mL·min－1，結(jié)果內(nèi)標(biāo)和丙戊酸鈉保留時(shí)間分別為30min和45min[3]；而本試驗(yàn)條件下保留時(shí)間縮短，內(nèi)標(biāo)和丙戊酸鈉保留時(shí)間分別約為5.5min和8.8min。另考察衍生化時(shí)衍生試劑的選擇、溫度、時(shí)間[4，5]，結(jié)果以2-溴-對(duì)硝基苯乙酮為衍生化試劑，溫度控制在50℃，時(shí)間為10min，衍生較完全。

丙戊酸鈉不溶于低極性的有機(jī)溶劑，需經(jīng)酸化轉(zhuǎn)化為丙戊酸后，才能用有機(jī)溶劑提取，本試驗(yàn)考察了使用1 mol·L－1和3 mol·L－1硫酸酸化，結(jié)果表明3 mol·L－1硫酸酸化較為完全，萃取回收率高。吸取上清液時(shí)應(yīng)注意不可將水帶入，否則會(huì)使衍生化不完全，水分難吹干而影響測(cè)定結(jié)果。在水浴中衍生化時(shí)，應(yīng)在帶塞容器中進(jìn)行，以免長(zhǎng)時(shí)間加熱使游離的丙戊酸揮發(fā)，影響測(cè)定。本法采用條件簡(jiǎn)便，精密度和準(zhǔn)確性均符合測(cè)定要求，可適用于該藥臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)。

[1]李金恒主編.臨床治療藥物監(jiān)測(cè)的方法和應(yīng)用[M].第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:40.

[2]祝文兵，陽利龍，李望云，等.我院兒科抗癲癇藥物血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J].兒科藥學(xué)雜志，2004，10（5）:25.

[3]孫增先，張騫峰，周金玉，等.柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定丙戊酸鈉血藥濃度[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，2004，13（2）:93.

[4]張志國(guó)，雷力力，李 冬，等.HPLC法測(cè)定丙戊酸鈉血藥濃度的衍生化影響因素考察[J].中國(guó)藥房，2010，21（34）:3204.

[5]李順煒，毛名楊，李國(guó)忠.改進(jìn)的柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定人血清中丙戊酸鈉濃度[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2005，25（8）:713.