謝健，閔蘇（1.重慶市急救醫(yī)療中心麻醉科，重慶市 400030；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，重慶市 400016）

參附注射液（Shenfu injection，SFI）主要含人參皂苷和烏頭堿。近年來，大量臨床研究將SFI用于器官、組織缺血再灌注時(shí)保護(hù)性治療，以達(dá)到減輕缺血再灌注損傷的目的，并取得了良好效果[1～4]。本研究擬探討SFI對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障和皮質(zhì)神經(jīng)元病理學(xué)有無影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

721型分光光度儀（上海濟(jì)成分析儀器廠）；水浴箱（上海人和科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16A型離心機(jī)（上海精密儀器儀表公司）；EM FC7型超薄切片機(jī)（德國 Leica公司）；Hitachi-7500型透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.2 試藥

SFI（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號:071108）；水合氯醛（青島匯和化工有限公司，批號:070621）；伊文思藍(lán)（EB，美國進(jìn)口分裝，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 動物

清潔級健康SD大鼠80只，♂，體重200～270 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號:SCXK（渝）200220001）。

2 方法

2.1 復(fù)制模型、分組和給藥

實(shí)驗(yàn)分為4組，即空白對照、假手術(shù)、模型和SFI組。麻醉前禁食6 h，采用Zea Longa線栓法[5]制備大鼠右側(cè)大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）缺血2 h再灌注24h模型。iv給藥。

2.2 指標(biāo)的測定

2.2.1 血腦屏障病理改變的觀察 于缺血2 h再灌注24h即刻麻醉后開胸，主動脈插管，生理鹽水沖洗血液，待右心房切口流出液無色透明時(shí)用2.5%戊二醛固定液進(jìn)行灌注固定。灌注結(jié)束后開顱取腦，取右側(cè)頂葉皮質(zhì)，用雙面刀片修塊成1mm3大小，浸入上述固定液中繼續(xù)固定2 h以上。之后用1%鋨酸固定，梯度酒精脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，切片機(jī)制成超薄切片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察血腦屏障的病理改變（腦毛細(xì)血管周圍水腫情況和毛細(xì)血管管腔受壓迫情況）和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的病理改變。

2.2.2 腦組織EB含量的測定 大鼠缺血2 h再灌注24h即刻進(jìn)行麻醉，iv 2%EB生理鹽水溶液2mL·kg-1，1 h后加深麻醉，開胸，經(jīng)左心室向主動脈插管并以生理鹽水灌注沖洗血管內(nèi)的EB直至右心切口流出液變得澄清透明。斷頭取腦，將左右大腦半球分開，去除皮質(zhì)表面的蛛網(wǎng)膜、血凝塊及腦室脈絡(luò)叢，放入5倍于其體積的甲酰胺中，37℃水浴48 h，離心，取上清液在620 nm波長處測吸光度（OD）值，甲酰胺作空白對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出EB含量（μg·mL-1），腦組織EB含量為上述值的5倍。

2.2.3 神經(jīng)功能缺損評分 于缺血2 h和再灌注24h分別進(jìn)行Longa[5]神經(jīng)功能缺損評分。0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分:輕度神經(jīng)功能缺損，提尾懸空時(shí)不能伸展左前爪；2分:中度神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分:中度神經(jīng)功能缺損，行走困難，并向左側(cè)傾倒；4分:重度神經(jīng)功能缺損，不能自發(fā)行走。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠血腦屏障的病理改變

空白對照、假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管周圍及管腔未見明顯變化；模型組大鼠大腦皮質(zhì)毛細(xì)血管周圍水腫和毛細(xì)血管管腔受壓的改變嚴(yán)重；SFI組相應(yīng)區(qū)域毛細(xì)血管周圍水腫和毛細(xì)血管管腔受壓程度顯著輕于模型組。各組血腦屏障病理改變見圖1。

3.2 大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的病理改變

空白對照、假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元未見明顯變化；模型組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元腫大，細(xì)胞膜連續(xù)性中斷，胞漿腫脹、空泡化，細(xì)胞核腫脹、破裂，核基質(zhì)密度增加，異染色質(zhì)增加；SFI組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元腫脹，細(xì)胞膜邊界欠清楚，胞漿腫脹，細(xì)胞核腫脹，核膜完整，核基質(zhì)密度輕度增加，異染色質(zhì)輕度增加。各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元病理改變見圖2。

3.3 大鼠腦組織內(nèi)EB含量

空白對照、假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)EB含量顯著低于模型組（P＜0.01），SFI組EB含量顯著低于模型組（P＜0.05）。各組腦組織EB含量見表1。

圖1 各組血腦屏障病理改變（EM，×15000）A.空白對照組；B.假手術(shù)組；C.模型組；D.SFI組Fig 1 Changes of the ultrastructure of blood-brain barrier（EM，×15000）A.blank control group；B.sham operation group；C.model group；D.SFI group

3.4 神經(jīng)功能缺損評分

缺血2 h時(shí)，空白對照、假手術(shù)組神經(jīng)功能缺損評分低于模型、SFI組（P＜0.01）。再灌注24h后，空白對照、假手術(shù)組評分低于模型、SFI組（P＜0.01），且SFI組顯著低于模型組（P＜0.01）。模型組再灌注24h評分高于其缺血2 h評分（P＜0.01），SFI組再灌注24h評分與其缺血2 h評分無顯著差異。各組神經(jīng)功能缺損評分見表2。

4 討論

Zea Longa線栓法[5，6]復(fù)制動物MCA缺血模型效果肯定、重復(fù)性好、操作簡單、不需特殊器械、無須開顱，可準(zhǔn)確控制缺血再灌注時(shí)間，MCA缺血及再灌注效果都很好。因此，筆者采用此方法造模。參考之前有關(guān)報(bào)道，本研究對每只大鼠實(shí)行缺血2 h、再灌注24h處理[7～9]。

局灶性腦缺血再灌注損傷是臨床上常見的病理過程，它引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病理學(xué)上的改變，是神經(jīng)功能障礙的基礎(chǔ)，與神經(jīng)功能的恢復(fù)和預(yù)后密切相關(guān)。因此，本研究重點(diǎn)觀察SFI對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的血腦屏障和皮質(zhì)神經(jīng)元的病理學(xué)變化有無影響。

圖2 各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元病理改變（EM，×3000）A.空白對照組；B.假手術(shù)組；C.模型組；D.SFI組Fig 2 Changes of the ultrastructure of cortical neuron（EM，×3000）A.blank control group；B.sham operation group；C.model group；D.SFI group

表1 各組腦組織EB含量（，n＝10）Tab 1 EB content in the cerebral tissue（，n＝10）

表1 各組腦組織EB含量（，n＝10）Tab 1 EB content in the cerebral tissue（，n＝10）

與模型組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.model group:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

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表2 各組神經(jīng)功能缺損評分（，n＝15）Tab 2 Neurologic impairment score of each group（，n＝15）

表2 各組神經(jīng)功能缺損評分（，n＝15）Tab 2 Neurologic impairment score of each group（，n＝15）

與空白對照、假手術(shù)組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.01vs.blank control，sham operation group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01

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本研究結(jié)果表明，SFI可減輕局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的血腦屏障和皮質(zhì)神經(jīng)元的病理改變，從而減輕相應(yīng)的功能受損傷程度。雖然缺血再灌注損傷的機(jī)制尚未闡明，但目前的研究認(rèn)為，腦缺血再灌注損傷后，血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞與以下因素有關(guān):氧自由基、炎性介質(zhì)、黏附分子、血小板活化因子、水通道蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等；神經(jīng)細(xì)胞損傷與以下因素有關(guān):氧自由基、鈣超載、凋亡相關(guān)基因、興奮性氨基酸、線粒體損傷和細(xì)胞能量代謝障礙等。而SFI具有以下藥理作用:清除氧自由基，減輕鈣超載，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)線粒體，降低細(xì)胞能量代謝障礙，降低促凋亡基因表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。這可能是本研究中SFI減輕局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障和腦皮質(zhì)神經(jīng)元病理學(xué)改變的原因[10～14]。

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