王 磊 ，馮 娜 ，李天松 ，劉玉秀 ，高玉偉 ，王鐵成 ，楊松濤 ，夏咸柱

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130062；3.吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062）

犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒（CDV）引起多種動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性病毒性傳染病[1]。CDV自然感染宿主在不斷擴(kuò)大，除犬科動(dòng)物外，還可感染大熊貓、小熊貓、獅、虎和豹等食肉目所有8個(gè)科，偶蹄目豬科、靈長(zhǎng)目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動(dòng)物。國內(nèi)外對(duì)犬瘟熱的預(yù)防仍然主要依賴于弱毒疫苗，而弱毒疫苗在使用過程中存在返祖、首免時(shí)受到母源抗體的干擾、引起一過性的免疫抑制和血小板減少、導(dǎo)致免疫動(dòng)物發(fā)生腦炎等現(xiàn)象[2]，因此，犬瘟熱病毒新型疫苗的研究迫在眉睫。

反向遺傳學(xué)技術(shù)（reverse genetic technique）是上世紀(jì)90年代在分子病毒學(xué)研究領(lǐng)域興起的新技術(shù)，也被稱為“病毒拯救（ the rescue of virus）”。1994年Schnell利用反向遺傳學(xué)技術(shù)首次成功拯救出狂犬病毒（RV），為負(fù)鏈RNA病毒的研究提供新的思路[3]。運(yùn)用反向遺傳技術(shù)可從cDNA水平進(jìn)行RNA病毒改造，可以有目的地改變病毒基因組結(jié)構(gòu)，獲得有感染性的重組病毒，從而研發(fā)出新型減毒活疫苗和新型病毒表達(dá)載體[4]。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建了CDV/R-20/8弱毒株全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒和病毒蛋白N、P、L基因的輔助表達(dá)質(zhì)粒，利用T7啟動(dòng)子和表達(dá)T7 RNA聚合酶的BSR細(xì)胞構(gòu)成的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行病毒拯救，獲得成功。在此基礎(chǔ)上我們對(duì)全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒進(jìn)行定向改造，將本病毒本身的F和H基因序列插入到M基因前非編碼區(qū)，構(gòu)建帶有雙囊膜糖蛋白的全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒，為下一步拯救具有雙囊膜糖蛋白基因的CDV和開展更為安全高效的重組CDV活載體疫苗及CDV病毒相關(guān)機(jī)制的研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

犬瘟熱病毒CDV/R-20/8疫苗株的反向遺傳操作系統(tǒng)及表達(dá)綠色熒光蛋白的重組犬瘟熱病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒（pCI-CDV-EGFP）、含犬瘟熱病毒H和F基因的重組質(zhì)粒pBluescript-F和pBluescript-H由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所人畜共患病研究室提供；T4 DNA連接酶、Pme I限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；其它限制性內(nèi)切酶均購自 TaKaRa 公司；Dephospharylation（BAP）Kit、2×PCR Solution Premix PrimeSTARRHS 購自TaKaRa公司；DH5α、TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pBluescript-F和pBluescript-H的轉(zhuǎn)化及回收

重組質(zhì)粒pBluescript-F和pBluescript-H轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用熱激法轉(zhuǎn)化，氨芐抗性平板篩選陽性菌落后挑取單菌落，用LB培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌，菌液OD值達(dá)0.5時(shí)按AXYGEN小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒小量提取，1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)對(duì)質(zhì)粒大小和濃度進(jìn)行鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pBluescript-F、pBluescript-H、pCI-c1-EGFP酶切及載體去磷酸化

用PmeI限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒pBluescript-F、pBluescript-H、pCI-c1-EGFP（c1 為 CDV基因組中的一段450 bp序列，在犬瘟熱病毒全基因中的位置為2962～3371）分別進(jìn)行單酶切，按AXY GEN凝膠回收試劑盒說明書回收酶切產(chǎn)物CDV-F、CDV-H基因片段及pCI-c1載體。pCI-c1載體回收后兩端為平末端，防止載體出現(xiàn)自連需去除5’端磷酸基團(tuán)，按 Dephospharylation（BAP）Kit說明書操作，反應(yīng)體系 50μL :10 ×BAP Buffer 5μL 、Bacterial Alkaline Phosphatase（BAP）2.5μL、載體片段 30μL、雙蒸餾水補(bǔ)至50μL。65℃水浴30min，去磷結(jié)束后回收載體，加入50μL的滅菌蒸餾水，即終體積為100μL，加入 300μL的 Buffer DE-A 及 150μL Buffer DE-B，混合均勻后置于制備管中，后續(xù)操作與凝膠回收一致。純化后的載體及CDV-F和CDV-H基因片段分別取出1μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小及濃度。

1.2.3 pCI-c1-F和pCI-c1-H質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)純化后載體與F、H目的片段按載體:片段摩爾比1:3進(jìn)行連接，連接用10μL反應(yīng)體系:10×T4 DNA 連接酶 Buffer 1μL、T4 DNA 連接酶 0.5μL、載體 2.5μL、目的基因片段（CDV-H、CDV-F）6μL。16℃連接過夜。熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。分別用EcoR I和BglII內(nèi)切酶鑒定pCI-C1-F和pCI-C1-H質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 全長(zhǎng)質(zhì)粒pCI-CDV-F和pCI-CDV-H的構(gòu)建

對(duì)全長(zhǎng)質(zhì)粒pCI-CDV-EGFP和正向連接的重組pCI-c1-F和pCI-c1-H質(zhì)粒用Sal I和Mlu I同時(shí)進(jìn)行雙酶切，全長(zhǎng)質(zhì)粒回收大載體（pCI-CDV-），重組pCI-c1-F和pCI-c1-H質(zhì)粒回收c1-F和c1-H目的基因片段。根據(jù)載體與目的片段大小和濃度，將載體與目的基因片段摩爾比為1:10進(jìn)行16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，平板30℃倒置培養(yǎng)，大量篩選陽性克隆并分別命名為pCI-CDV-F、pCI-CDV-H。

1.2.5 重組全長(zhǎng)質(zhì)粒鑒定

1.2.5.1 PCR鑒定

根據(jù)犬瘟熱病毒CDV/R-20/8疫苗株全基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物，由北京華大基因公司合成，引物序列如下:

PCR 反應(yīng)總體系 25μL:滅菌純水 18.25μL、10×ExBuffer 2.5μL、2.5mmol/L dN TP 2μL、ExTaq 0.25μL、上游引物（20 pmol/μL）0.5μL、下游引物（20 pmol/μL）0.5μL、重組質(zhì)粒 1μL。PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5min；95 ℃變性 30 s，50 ℃退火 40 s，72 ℃延伸1.5min，35個(gè)循環(huán):72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。

在后備牛不同年齡階段，生長(zhǎng)速度可能會(huì)影響乳房發(fā)育，但是在斷奶之后有影響，并不是斷奶前。圖1可以看出，3月齡前，體重生長(zhǎng)曲線和乳腺增長(zhǎng)曲線完全一致，這意味著，在3月齡前，不管怎么飼養(yǎng)，提供的營養(yǎng)物質(zhì)是高或是低，牛長(zhǎng)得快或慢，都不會(huì)對(duì)乳腺組織發(fā)育產(chǎn)生影響，即不會(huì)對(duì)后期產(chǎn)奶產(chǎn)生影響。

c引物擴(kuò)增完整外源基因:

PCR反應(yīng)總體系為 50μL，用 Premix Prime STAR HS預(yù)混液進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5min；98 ℃ 變性 10 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃ 延伸 3min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果，初步鑒定正確后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行精測(cè)序。

1.2.5.2 酶切鑒定

初步使用Pme I單酶切和Sal I+Mlu I雙酶切進(jìn)行鑒定，鑒定正確后用Sal I+Not I進(jìn)行雙酶切及用 Pst I、Cpo I、Xho I、Nhe I、Sma I進(jìn)行單酶切鑒定，酶切鑒定體系都為20μL，酶切體系和條件按TaKaRa內(nèi)切酶說明書操作過程見圖1和2示意圖。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒 pBluescript-F、pBluescript-H和pCI-c1-EGFP的Pme I酶切結(jié)果

質(zhì)粒pBluescript-H和pBluescript-F中，H和F基因兩端分別設(shè)計(jì)成相同的PmeI位點(diǎn)，單酶切時(shí)分別可以切下大小為 2036 bp（CDV-F）和 1886 bp（CDV-H）的目的片段，質(zhì)粒pCI-c1-EGFP中，EGFP基因兩端為PmeI酶切位點(diǎn)，可切下726bp的片段（圖3）。

2.2 重組質(zhì)粒pCI-c1-F和pCI-c1-H酶切及正反向鑒定

Pme I酶切后為平末端，CDV-F和CDV-H基因連接到pCI載體上后需進(jìn)行正反向鑒定，用EcoR I酶切pCI-c1-F質(zhì)粒后若是正連，酶切結(jié)果為:1413 bp和4987 bp；若反連，酶切結(jié)果為575 bp和5825 bp。對(duì)pCI-c1-H質(zhì)粒，若正連，Bgl II內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后可切出3724 bp和2468 bp；若是反連，酶切后可以切出4745 bp和1078 bp。圖4結(jié)果顯示篩選出連接正確的陽性重組質(zhì)粒pCI-c1-F和pCI-c1-H。

2.3 重組全長(zhǎng)質(zhì)粒pCI-CDV-F、pCI-CDV-H PCR及酶切鑒定

PCR鑒定過程中，上游引物在插入的CDV-F和CDV-H基因中，下游引物在插入基因的外面，對(duì)CDV-F基因，上游引物在6352 bp位置（F基因在全基因組中的位置為:4935～6923 bp），對(duì)CDV-H基因，上游引物在7954 bp位置（H基因在全基因組中的位置為:7079～8902 bp）；下游引物在全基因組中的位置為4043 bp，以上兩種基因插入的位置為全基因組中3371 bp，因此若無目的片段插入，兩對(duì)引物均不能擴(kuò)增出條帶；對(duì)pCI-CDV-F質(zhì)粒，若正確插入目的片段，可擴(kuò)增出1243 bp片段；對(duì)pCI-CDV-H質(zhì)粒，可擴(kuò)增出1611 bp片段。而第三對(duì)引物擴(kuò)增出的片段大小 pCI-CDV-F為2686 bp、pCI-CDV-H為 2536 bp。如圖5所示PCR擴(kuò)增結(jié)果均正確。

2.3.2 酶切鑒定結(jié)果

CDV-H和F基因兩端均為Pme I酶切位點(diǎn)，用此酶進(jìn)行單酶切時(shí)可以從全基因質(zhì)粒中切出CDV-F為2036 bp和CDV-H為1886 bp的片段。Pme I酶切位點(diǎn)上游410 bp左右的位置含Sal I酶切位點(diǎn)，下游2 bp位置含Mlu I酶切位點(diǎn)，用以上兩種酶同時(shí)進(jìn)行雙酶切，可以從全基因質(zhì)粒中酶切出目的片段為:CDV-F（2486 bp）、CDV-H（2336 bp）。酶鑒定正確后，用 Noc I、Xho I、Sma I、Nhe I、Pst I進(jìn)行單酶切鑒定，Sal I+Not I進(jìn)行雙酶切鑒定全長(zhǎng)質(zhì)粒丟失情況，鑒定結(jié)果如圖6所示，沒有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒丟失，與計(jì)算結(jié)果一致。

3 討論

犬瘟熱病毒基因組為非分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA。負(fù)鏈RNA病毒的主要特點(diǎn)是基因組RNA不具有感染性，而且裸露的基因組RNA本身也不能作為模板，只有在與核蛋白N/NP結(jié)合成核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體后，才能作為模板起始復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并表達(dá)和包裝出活病毒，關(guān)鍵是獲得有功能的RNP[5]。RNA病毒感染性克隆的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了從病毒整體與分子之間、病毒與宿主關(guān)系方面研究病毒的毒力和致病性。采取基因敲除、插入、置換、或構(gòu)建嵌和病毒等方法對(duì)病毒基因功能進(jìn)行研究，本研究旨在將犬瘟熱病毒的囊膜糖蛋白插入到M基因前面的非編碼區(qū)，構(gòu)建重組CDV cDNA全長(zhǎng)質(zhì)粒。使用了pCI真核表達(dá)載體，CMV/T7啟動(dòng)子的反向遺傳操作系統(tǒng)。T7啟動(dòng)子是一種具有高特異性和功能強(qiáng)大的原核啟動(dòng)子，但在真核細(xì)胞感染表達(dá)T7 RNA聚合酶的BSR細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功在BSR細(xì)胞中拯救出犬瘟熱病毒），同樣可以使真核細(xì)胞中的T7啟動(dòng)子序列發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用[6]。

CDV囊膜表面的纖突是由H和F兩種糖蛋白組成的[7]。研究表明H、F蛋白是宿主免疫系統(tǒng)的主要目的抗原，是產(chǎn)生中和抗體的重要抗原。二者在病毒的吸附和侵入宿主細(xì)胞過程中起作用，病毒通過H蛋白吸附到細(xì)胞表面的受體上，并協(xié)助F蛋白介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜、感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞的融合，使病毒在宿主體內(nèi)擴(kuò)散。H蛋白主要誘導(dǎo)了體液免疫，并且抗CDV H蛋白單克隆抗體（MoAb）具有中和病毒活性；F蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能阻止病毒感染，并且在有病毒增殖的情況下抑制癥狀的發(fā)生。用相關(guān)或非相關(guān)病毒的糖蛋白基因取代自身糖蛋白基因后的重組病毒也已成功用于疫苗研制[8]。在狂犬病毒（RV）研究中，RABV G 蛋白是唯一的膜蛋白并誘導(dǎo)VNA（中和抗體）的產(chǎn)生，額外的RABV G 蛋白（2個(gè)或3個(gè)）被克隆至RABV 基因組，并成功拯救出攜帶2～3個(gè)G蛋白基因的衰減病毒，使得G蛋白表達(dá)量增加，其致病性進(jìn)一步下降，免疫原性提高，由此可見，過度表達(dá)G蛋白可潛在的增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答及提高保護(hù)率[9-10]。本研究選擇囊膜糖蛋白并分別構(gòu)建了雙囊膜糖蛋白基因的全長(zhǎng)質(zhì)粒，其目的就是想借助反向遺傳操作平臺(tái)進(jìn)行免疫原性比較，篩選出致病性低、免疫原性好的致弱犬瘟熱病毒疫苗株，并對(duì)其致病機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步探討。

病毒基因組全長(zhǎng)片段的克隆是反向遺傳操作技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，全長(zhǎng)cDNA克隆的穩(wěn)定性嚴(yán)重制約病毒拯救的效率。本試驗(yàn)在篩選全長(zhǎng)質(zhì)粒中存在著大量質(zhì)粒片段丟失情況，用DH5a感受態(tài)細(xì)胞先后轉(zhuǎn)化篩選數(shù)百次都未獲得成功，改用TOP10感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，將轉(zhuǎn)化后氨芐篩選平板溫度降低到30℃進(jìn)行培養(yǎng)，挑取陽性菌落后在30℃環(huán)境中液體搖菌培養(yǎng)，最終篩選出完整的全長(zhǎng)質(zhì)粒。這種病毒基因組插入載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后易出現(xiàn)突變、重排、缺失、插入和替換現(xiàn)象，原因之一可能是重組質(zhì)粒中的某些基因?qū)λ拗骶卸拘?，使有重組載體的菌死亡或者宿主菌為存活需要對(duì)重組載體進(jìn)行“改造”，從而導(dǎo)致了全長(zhǎng)基因克隆的不穩(wěn)定[11]。

表達(dá)細(xì)胞色素C的重組狂犬病毒可以加速細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)免疫應(yīng)答并降低致病性。在病毒基因組表達(dá)細(xì)胞因子可以潛在增強(qiáng)病毒的免疫應(yīng)答，進(jìn)而起保護(hù)作用[12]，為下一步定向改造犬瘟熱病毒提出另一路線。以構(gòu)建CDV全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒為基礎(chǔ)，進(jìn)行基因突變或與其它疫苗株及野生毒株基因置換，以及天然免疫相關(guān)細(xì)胞因子的插入研究等，可以建立CDV免疫原性和致病性的研究平臺(tái)，同時(shí)引入外源基因進(jìn)行表達(dá)，提高疫苗的保護(hù)率等方面的研究正在進(jìn)行。

[1]鞠會(huì)艷，高玉偉，夏咸柱，等.犬瘟熱病毒小熊貓株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2010，41（5）:112-119.

[2]程世鵬，易立.犬瘟熱病原學(xué)研究進(jìn)展[J].特產(chǎn)研究，2009（1）:59-62.

[3]郭利，馮娜，夏咸柱，等.狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth疫苗株反向遺傳系統(tǒng)的建立 [J].微生物學(xué)報(bào)，2008，49（7）:949-954

[4]王煜，張七斤.RNA病毒反向遺傳學(xué)的研究方法和應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2008（4）:14-16.

[5]胡孔新，于建石，李德新，等.麻疹病毒全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建及其感染性的研究[J].病毒學(xué)報(bào)，2004，20（3）:210-213.

[6]Fuerst T R，Niles E G，Studier F W，et al.Eukaryotic transient expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase[J].Proc Natl Acad Sci USA，1986，83（21）:8122-8126.

[7]徐向明，朱善元，張泉，等.犬瘟熱病毒DNA疫苗接種犬的免疫保護(hù)[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28（9）:1011-1014.

[8]Collins P L，Whitehead S S，Burkreyev A，et al.Rational design of live-attenuated recombinant vaccine virus for human respiratory syncytial virus by reverse genetics[J].Adv Virus Res，1999，54（39）:423-451.

[9]Faber M，Li J，Kean RB，et al.Effective preexposure and postexposure prophylaxis of rabies with a highly attenuated recombinant rabies virus[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（27）:11300-11305.

[10]Faber M，Pulmanausahakul R，Hodawadekar S S，et al.Overexpression of the rabies virus glycoprotein results in enhancement of apoptosis and antiviral immune response[J].J Virol，2002，76（7）:3374-3381.

[11]吳波平，時(shí)洪艷，馮力，等.反向遺傳操作研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39（1）:134-138.

[12]王化磊.表達(dá)免疫刺激因子的重組狂犬疫苗對(duì)狂犬病的暴露前及暴露后預(yù)防研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2010.