張 梅，趙 雨，李蕓彤，徐云鳳，曲曉波

長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，長春 130117

哈蟆油(Oviductus Ranae)是中國雌性林蛙(Rana temporaria chensinensis David)的干燥輸卵管[1]。據(jù)報(bào)道，哈蟆油具有促進(jìn)卵泡早熟及卵泡增殖作用，對性周期有明顯的影響，可延長興奮期，有良好的強(qiáng)精作用；同時(shí)具有補(bǔ)虛、退熱之功效，可用于治療精血不足、體虛氣弱、肺虛咳、神經(jīng)衰弱、記憶減退、產(chǎn)后無乳以及肺結(jié)核、肝炎等消耗性疾病[2-3]。哈蟆油遇水膨脹后黏稠度很大，水溶性較低，不利于人體吸收及產(chǎn)品加工。哈蟆油的主要成分是蛋白質(zhì)，約占60%[4-5]。本研究采用堿性蛋白酶制備了低粘度、高溶解性的哈蟆油酶解物，同時(shí)進(jìn)行了抗疲勞、耐缺氧、降血脂等相關(guān)藥理活性研究，為哈蟆油的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

DS-1型組織勻漿器(上海正慧工貿(mào)有限公司)；HH.S21-8-S型恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；TDL-5-A型離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)；LL3000型冷凍干燥機(jī)(德國Heto公司)；DV-Ⅱ+P型旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)（Brookfield 公司）；游泳箱(50cm×40cm×35 cm)。

堿性蛋白酶(Sigma公司)；血清總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒均購自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所。

1.2 藥材

哈蟆油購于吉林省白山市北亞藥業(yè)，經(jīng)本校中藥鑒定教研室姜大成教授鑒定為中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙的干燥輸卵管。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級BALB/C種雄性小鼠140只，體重為(20±2)g，Wistar 雄性大鼠 96 只，體重為(180±20)g，購于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：SCXK—（吉）2008—0005。

2 方法與結(jié)果

2.1 哈蟆油酶解物的制備

哈蟆油去除筋膜等雜質(zhì)后晾干，研磨成粉末，精確稱取100.0 g粉末，蒸餾水發(fā)制24 h后勻漿。加熱煮沸4 h，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值為8.5。按酶與底物濃度為1000U·g-1加入堿性蛋白酶，60℃酶解30min，加熱煮沸10 min滅酶活。5000 r·min-1離心20 min，取其上清液，真空冷凍干燥，凍干品即為哈蟆油酶解物，凍干品收率為87.2%。酶解后的哈蟆油由最初粘度3127 mPa.s降為8.86 mPa.s；Folin-酚法測其蛋白含量為57.4%；硫酸-苯酚法測其糖含量為25.3%。

2.2 哈蟆油酶解物抗疲勞試驗(yàn)

小鼠70只，隨機(jī)等分為7組(n=10)，即哈蟆油及其酶解物低、中、高劑量組(0.15、0.3、0.6 g·kg-1)和空白對照組，空白對照組給予等體積的蒸餾水。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥30 d。末次給予受試樣品30 min后，將尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深約30 cm，水溫(25±1.0)℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時(shí)間，即小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析。

由表1可知，酶解前后各劑量組與對照組比較均能延長小鼠游泳時(shí)間，酶解前低劑量組延長具有顯著性意義(P＜0.05)，酶解后各劑量組延長均無顯著性意義 (P＞0.05)。表明哈蟆油具有一定的抗疲勞作用，而酶解物抗疲勞作用不明顯。

2.3 哈蟆油酶解前后的耐缺氧試驗(yàn)

末次給藥1 h后，將各組小鼠逐只放入盛有5 g鈉石灰的250 mL磨口瓶內(nèi)，每瓶1只，加蓋，以凡士林密封瓶口，旋緊密封，立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止時(shí)間為指標(biāo)，觀察小鼠因缺氧而死亡時(shí)間，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析。

由表1可知，酶解前后各劑量組與對照組比較均能延長小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間；酶解前各劑量組無顯著性意義(P＞0.05)；酶解后各劑量組具有顯著性意義(P＜0.05)。表明哈蟆油酶解物能明顯增強(qiáng)小鼠耐缺氧能力，減少缺氧對機(jī)體重要器官功能的影響。

2.4 哈蟆油酶解物輔助降血脂試驗(yàn)

2.4.1 大鼠分組與給藥大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察5 d，取尾靜脈血測定TC、TG和HDL-C等各項(xiàng)血脂指標(biāo)。將大鼠隨機(jī)分為8組，每組12只，并適當(dāng)調(diào)整使各組大鼠的TG、HDL-C及初始體重盡可能均衡。設(shè)基礎(chǔ)飼料對照組，高脂模型對照組（高脂組），蛤蟆油及其酶解物低、中、高3個(gè)劑量的試驗(yàn)組（劑量分別為 0.05、0.1、0.2 g·kg-1）?；A(chǔ)飼料對照組給予合成飼料，高脂組給予高脂飼料，受試各劑量組在給予高脂飼料的同時(shí)給予受試藥物。每周稱重一次，并根據(jù)體重調(diào)整給藥量。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥30 d。

表1 哈蟆油及其酶解物對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間的影響(n=10,±s)

表1 哈蟆油及其酶解物對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間的影響(n=10,±s)

注：*與對照組相比P＜0.05，表示差異顯著。

2.4.2 測定指標(biāo)依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003版[6]相關(guān)規(guī)定，采用脂代謝紊亂模型法-預(yù)防性給受試樣品，試驗(yàn)至第30 d取血，采用酶聯(lián)法測定TC、TG和HDL-C含量，采血前動(dòng)物禁食16 h，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析。

由表2可知，試驗(yàn)前對照組、高脂組及各劑量組各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)后高脂組與對照組比較，TC、TG含量均比對照組升高，且具有顯著性差異(P＜0.05)，表明高脂模型組建模成功。

表2 哈蟆油酶解物對大鼠血脂的影響(n=12，±s)

表2 哈蟆油酶解物對大鼠血脂的影響(n=12，±s)

注：*與高脂模型組相比P＜0.05，#與基礎(chǔ)對照組相比P＜0.05，表示差異顯著。

實(shí)驗(yàn)后各用藥組與高脂模型組比較，各劑量組TC含量均降低，且蛤蟆油及其酶解物低、高劑量組TC含量降低具有顯著性意義(P＜0.05)；各劑量組TG含量降低也具有顯著性差異(P＜0.05)。表明哈蟆油酶解物具有輔助降血脂的作用。

3 討 論

運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力增強(qiáng)的最有力表現(xiàn)，游泳時(shí)間的長短可以反映運(yùn)動(dòng)疲勞的程度[7]。提高機(jī)體的耐缺氧能力，就是要通過降低機(jī)體缺氧應(yīng)激強(qiáng)度、促進(jìn)缺氧適應(yīng)等手段，減弱缺氧對機(jī)體的損傷，使機(jī)體在長期缺氧環(huán)境中盡可能維持較正常的生理機(jī)能[8]?，F(xiàn)有研究表明，血脂在維持人體正常生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[9-10]。而血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平是反映機(jī)體脂質(zhì)代謝的主要指標(biāo)。

采用酶法水解蛋白，即可以產(chǎn)生大量具有多種生物功能的多肽，同時(shí)反應(yīng)底物、反應(yīng)劑和反應(yīng)環(huán)境沒有污染[11]。本研究通過對哈蟆油酶解物的抗疲勞、耐缺氧及降血脂作用的研究，表明哈蟆油酶解物能延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間及缺氧小鼠的存活時(shí)間，提高小鼠耐缺氧能力，維持小鼠較正常的生理機(jī)能；同時(shí)，哈蟆油酶解物各劑量組對甘油三酯含量的降低均具有顯著性意義，其中低、中劑量組尤為顯著，高劑量組效果次之，為考察降低甘油三酯量效關(guān)系提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；哈蟆油酶解物也能顯著降低大鼠血清總膽固醇含量，根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003版)[6]，在血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇三項(xiàng)指標(biāo)檢測中血清總膽固醇和甘油三酯二項(xiàng)指標(biāo)陽性，可判定該哈蟆油酶解物保留了蛤蟆油的輔助降血脂功能，為哈蟆油保健產(chǎn)品的研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

[1] 劉永鎮(zhèn)，徐光俊.哈蟆油真?zhèn)舞b別研究的回顧和展望[J].延邊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 1990，3(1)：70-2.

[2] 王春林.哈什蟆油甾體性激素定量分析及藥理作用[J].中藥通報(bào)，1985，10(2)： 44-47.

[3] 沼田光弘.游離脂肪酸新制劑[J].化學(xué)工業(yè)，1986，(10)：763-768.

[4] 王 萍，楊春瑜.林蛙油的成分及開發(fā)利用前景[J].國土與自然資源研究， 1999，(2)：69-73.

[5] 林紀(jì)嫻，廖靜華.中國林蛙油與中華大蟾蜍輸卵管的蛋白質(zhì)成分研究[J]. 中藥材，1986，(6)：15-20.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范[S].2003.

[7] 孫冬菊，黃德苓，張兆強(qiáng)，等.無花果水提取物對小鼠抗疲勞、耐缺氧作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].職業(yè)與健康，2007，23(13)：1105-1108.

[8] 張 旭，張汝學(xué).中藥復(fù)方提高機(jī)體耐缺氧能力及機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊，2007，(9)：18-24.

[9] 李來好，戚 勃，楊少玲.麒麟菜膳食纖維的降血脂功能[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2008，15(6)：944-948.

[10] 張純萍，劉雪萍，黃興振，等.茶籽油降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥效學(xué) [J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(5)：596-598.

[11] 馬燕梅.林蛙油酶解條件的優(yōu)化及其蛋白水解營養(yǎng)液的研制[D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2007.