劉 維 ，張 磊 ，吳沅皞

（1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

解毒通絡(luò)法控制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀的實驗研究*

劉 維1，張 磊1，吳沅皞2

（1天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

[目的]探討解毒通絡(luò)法對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病理進展中炎性因子的控制作用。[方法]復(fù)制膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠，隨機分為空白對照組，模型對照組，清痹片低劑量組、中劑量組、高劑量組，并以甲氨蝶呤治療組作為陽性對照，致炎第21天起每天給藥干預(yù)。從第1天初次免疫前開始，每隔2 d采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分法分別評價各鼠前后4爪，記錄多發(fā)性關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)生及嚴(yán)重程度；同時用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量各鼠踝關(guān)節(jié)左右徑（TD）、前后徑（AD）及足墊厚度（PT）。分別于第1天和第49天對動物行X線放射學(xué)檢查其后爪，并以X線片評分評價其關(guān)節(jié)破壞程度。[結(jié)果]模型組CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)改變量及X線片評分、雙側(cè)踝關(guān)節(jié)左右徑、前后徑及足墊厚度的改變量與空白對照組比較顯著增加（P<0.01）；清痹片中、高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)改變量與模型組相比顯著降低（P<0.01）；清痹片高劑量組X線片評分、踝關(guān)節(jié)左右徑、前后徑及足墊厚度的改變量與模型組相比顯著降低（P<0.01）；清痹片高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)改變量、踝關(guān)節(jié)前后徑改變量及X線片評分與陽性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。[結(jié)論]解毒通絡(luò)法能對抗膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥病變進展，減輕炎癥癥狀。

解毒通絡(luò)法；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)炎癥狀

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）屬于中醫(yī)“痹證”范疇，因其疼痛遍歷周身關(guān)節(jié)，后期身體羸弱、關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞，又有骨痹、歷節(jié)病、頑痹、尫痹等名稱。RA是高致殘性疾病，RA患者病程遷延，致殘率高，3 a內(nèi)關(guān)節(jié)破壞可達(dá)70%[1]，極大影響了患者群的生活質(zhì)量，開展干預(yù)RA研究對于人類健康具有重要的意義。本研究以清痹片為研究載體，探討解毒通絡(luò)法組方的中藥對RA關(guān)節(jié)炎癥狀進展的干預(yù)作用，為中醫(yī)藥治療RA的機制研究和推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 牛Ⅱ型膠原（CollagenTypeⅡ，CⅡ）購自美國BD公司，不完全弗氏佐劑（CFA）購自美國Sigma公司，清痹片（QT），本院制劑室提供，由白花蛇舌草、青風(fēng)藤、乳香、沒藥、黃芪、生地、甘草等組成。甲氨蝶呤（MTX），中國山西普德藥業(yè)生產(chǎn)（批號：080706）。

1.2 動物造模 清潔級Lewis大鼠90只，雄性，7周齡，體質(zhì)量（160±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：2005-0003。飼養(yǎng)環(huán)境：天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院清潔級動物房。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水，攝食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自然光線。動物房溫度、濕度分別維持在20℃、70%左右。隨機選取15只作為空白對照組，其他大鼠復(fù)制膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）模型。造模前1 d將CⅡ溶于0.1mol/L冰醋酸中，濃度為2 g/L，在4℃下震蕩使之充分溶解，置于4℃冰箱中過夜，冰浴下按1∶1比例與不完全弗氏佐劑混和充分乳化，麻醉大鼠后于尾根部皮內(nèi)注射（每只0.2mL，含牛Ⅱ型膠原200μg），21 d后同法加強注射膠原乳化劑1次，空白對照組等量注射不完全弗氏佐劑[2]。

1.3 動物分組處理 選取造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為模型對照組、QT低劑量組、QT中劑量組、QT高劑量組和陽性對照組，致炎第21天起每天給藥：QT低、中、高劑量組以清痹片水溶液灌胃，劑量分別為0.36、1.0和1.8 g/（kg·d）；陽性對照組，腹腔注射MTX，7.5mg/（kg·周）；模型對照組和空白對照組給予10mL/（kg·d）生理鹽水灌胃。實驗期間均予SPF級普通飼料。

1.4 關(guān)節(jié)炎癥狀評分 從第1天初次免疫前開始，每隔2 d采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分分級法評價各鼠前后4爪，記錄多發(fā)性關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)生及嚴(yán)重程度[3-4]。關(guān)節(jié)炎指數(shù)分為 5級（0～4分）：0分，關(guān)節(jié)無紅腫。1分，1個關(guān)節(jié)部位發(fā)紅，并（或）見腫脹。2分，發(fā)紅并（或）腫脹關(guān)節(jié)>1個。3分，整個前（后）爪發(fā)紅并（或）腫脹。4分，包括腕、踝關(guān)節(jié)全部嚴(yán)重紅腫，或關(guān)節(jié)強直或畸形?？傆嬜罡呖煞e16分（4分×4爪）。與初次免疫前相比，AI增加至少2分則認(rèn)為具有關(guān)節(jié)炎癥狀。于AI評估同時，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量各鼠踝關(guān)節(jié)左右徑（TD）、前后徑（AD）及足墊厚度（PT）[4-5]。

1.5 X線放射學(xué)檢查 分別于第1天和第49天對動物行X線放射學(xué)檢查其后爪，并以X線片評分評價其關(guān)節(jié)破壞程度：0分，正常關(guān)節(jié)。1分，1個位點的輕度骨質(zhì)破壞，或骨質(zhì)脫礦物質(zhì)改變。2分，中度改變，一個小范圍內(nèi)2～4個點破壞，或1～2處骨侵蝕。3分，關(guān)節(jié)嚴(yán)重侵蝕。4分，關(guān)節(jié)完全破壞[4，6]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 整理各動物X線片評分?jǐn)?shù)據(jù)及AI得分?jǐn)?shù)據(jù)，計算各動物從21～34 d的AI改變量（ΔAI），分別計算各鼠雙側(cè)踝關(guān)節(jié)左右徑、前后徑及足墊厚度的改變量之和（ΔTD，ΔAD 及 ΔPT），以上實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，正態(tài)分布資料組間比較采用單因素方差分析（oneway-ANOVA），偏態(tài)分布資料組間比較采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIA大鼠模型制備情況 初次免疫次日，大鼠免疫側(cè)踝關(guān)節(jié)皮膚開始發(fā)紅，腫脹。致炎后9～17 d，大鼠四肢關(guān)節(jié)紅腫加重，以雙側(cè)后足踝關(guān)節(jié)明顯，足墊增厚，大鼠活動量減少，食欲下降，毛發(fā)失去光澤，皮內(nèi)注射部位出現(xiàn)多處小潰瘍，隨后結(jié)痂愈合。5周左右大鼠關(guān)節(jié)炎病變最為嚴(yán)重，活動困難，體質(zhì)量增長緩慢，甚至下降。其后關(guān)節(jié)腫脹逐漸減退，部分大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)強直，活動明顯受限。所有造模大鼠均成功復(fù)制CIA模型，無死亡。

2.2 一般發(fā)病情況 空白對照組大鼠皮毛光澤色白，精神佳、活潑，飲食正常。模型組大鼠皮毛暗淡無光澤，部分大鼠爬行困難、緊張易怒、瘦弱蜷縮。清痹片低劑量組大鼠皮毛枯糙發(fā)黃，倦怠懶動，體質(zhì)量增長緩慢。清痹片中、高劑量組和陽性對照組大鼠皮毛較光澤、精神活躍、進食狀況較好。

2.3 解毒通絡(luò)法對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)及X線片評分的影響 如表1所示，模型組CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)改變量及X線片評分與空白對照組比較顯著增加（P<0.01），清痹片中、高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)改變量與模型組相比顯著降低（P<0.01），清痹片高劑量組X線片評分與模型組相比顯著降低（P<0.01），清痹片高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)改變量及X線片評分與陽性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表1 解毒通絡(luò)法對CIA大鼠ΔAI及X線片評分的影響（±s)Tab.1 Effectof dispelling toxinsand dredging collaterals on AIand radiologicalscoresof the CIA rats（±s)分

表1 解毒通絡(luò)法對CIA大鼠ΔAI及X線片評分的影響（±s)Tab.1 Effectof dispelling toxinsand dredging collaterals on AIand radiologicalscoresof the CIA rats（±s)分

注：與模型組比較*P<0.01；與陽性對照組比較#P<0.01。

組別 n空白對照組 15模型對照組 15 QT低劑量組 15 QT中劑量組 15 QT高劑量組 15陽性對照組 15 ΔAI X線片評分0.00±0.00* 0.00±0.00*6.13±1.28# 3.08±1.32#5.32±1.33# 2.84±1.16#3.54±1.41*# 2.31±1.28#1.11±0.93* 1.92±1.23*0.97±1.29* 1.84±1.14*

2.4 解毒通絡(luò)法對CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響如表2所示，模型組CIA大鼠雙側(cè)踝關(guān)節(jié)左右徑、前后徑及足墊厚度的改變量與空白對照組比較均有顯著增加（P<0.01）。清痹片中劑量組踝關(guān)節(jié)前后徑及足墊厚度的改變量與模型組比較差異有顯著性（P<0.01）。清痹片高劑量組踝關(guān)節(jié)左右徑、前后徑及足墊厚度的改變量與模型組比較均有顯著降低（P<0.01），其中，前后徑改變量與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

表2 解毒通絡(luò)法對CIA大鼠ΔTD、ΔAD及ΔPT的影響（±s)Tab.2 Effectof dispelling toxinsand dredging collaterals on the TD,AD and PT of the CIA rats（±s)mm

表2 解毒通絡(luò)法對CIA大鼠ΔTD、ΔAD及ΔPT的影響（±s)Tab.2 Effectof dispelling toxinsand dredging collaterals on the TD,AD and PT of the CIA rats（±s)mm

注：與模型組比較，*P<0.01；與陽性對照組比較，#P<0.01。

組別 n空白對照組 15模型對照組 15 QT低劑量組 15 QT中劑量組 15 QT高劑量組 15陽性對照組 15 ΔTD ΔAD ΔPT-0.31±0.12* 0.82±0.09* 0.46±0.29*-5.98±1.43# 5.23±1.32# 6.78±1.52-5.38±1.62# 4.56±1.24# 5.70±1.37#-4.50±1.64# 3.72±1.19*# 4.59±1.09*#-1.12±1.56*# 1.07±1.38* 2.01±1.17*#-0.57±0.89* 1.11±1.44* 2.41±1.58*

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎乃濕熱瘀毒直達(dá)筋骨經(jīng)隧，深伏痼結(jié)，且邪勢猖獗，正氣難達(dá)，甚難搜剔祛除，以致反復(fù)發(fā)作，損形壞體[7]。故本病治療宜清熱解毒、活血通絡(luò)為基本治則。作為以解毒通絡(luò)立法治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎濕熱瘀阻型痹證協(xié)定處方的清痹片，是根據(jù)筆者多年臨床經(jīng)驗方活血清痹方優(yōu)化組合研制而成，由白花蛇舌草、青風(fēng)藤、防風(fēng)、乳香、沒藥、黃芪、生地、甘草等中藥組成，臨床對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的近期以及遠(yuǎn)期療效在臨床已被證實[8-9]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血單核細(xì)胞及關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞大量分泌炎性細(xì)胞因子在RA的急性滑膜炎、滑膜纖維化、骨和軟骨破壞等病情進展中起主導(dǎo)作用[10]。膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎動物模型可有效模擬類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理進展及癥狀特點，包括踝、腕等關(guān)節(jié)的紅腫、強直、畸變等病變。本研究復(fù)制膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠并以清痹片干預(yù)，結(jié)果表明活血通絡(luò)法能對抗膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥病變進展，減輕炎癥癥狀，可能機制為抑制相關(guān)炎性因子的分泌、釋放，并可能通過干預(yù)RA的Kupple樣因子6-卵泡抑素相關(guān)蛋白（KLF6-FRP）調(diào)控體系抑制炎性因子和滑膜增生等病理進展，進一步的研究正在進行之中。

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[3]Young-SoolHah,Mi Jeong Sung,Hye Song Lim,etal.Dietary alpha lipoic acid supplementation prevents synovial in Xammation and bone destruction in collagen-induced arthriticmice[J].Rheumatol Int,Rheumatol Int,2010,23:[Epub ahead ofprint]

[4]JoanaRFAbreu,WendyDontje,Sarah Krausz,etal.ARac1 inhibitory peptide suppresses antibody production and paw swelling in the murine collagen-induced arthritismodel of rheumatoid arthritis[J].ArthritisResearch&Therapy,2010,12:2-4.

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[10]Fionula Brennan,Jonathan Beech.Update on cytokines in rheumatoid arthritis[J].CurrOpin Rheumatol,2007,19:296-301.

Experimentalstudy on controlling symptomsof collagen-induced arthritiswith dispelling toxinsand dredging collaterals in rats

LIUWei1，ZHANG Lei1，WUYuan-hao2
（1.The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To explore the controlling effects of dispelling toxins and dredging collaterals on the inflammatory factors of rheumatoid arthritis.[Methods]Themodelof collagen-induced arthritis(CIA)was duplicated in rats.Theywere random ly divided into blank group,modelcontrolgroup,Qingbi tabletsof low,middle,high dosage groups,positive controlgroup(methylaminopterin group).The administration ofdrugwasstarted from the21stday.Beginningatthe firstday after immunization thearthritisindex(AI)was recorded every other day to evaluate the severity of the arthritic development in 4 claws of the rats.Meanwhile,the transverse diameter(TD),anteroposterior diameter(AD)and thick of feetpad(PT)of the ratsweremeasured with a digital caliper.The hind pawswere used for radiographic evaluation at the firstand the 49th day.[Results]The scoresof the X-raysand change of the AI,TD,AD and PTwere increased significantlycomparedwith thenormalgroup(P<0.01).TheAIoftheratstreatedwithQingbitabletsofmiddleandhighdosageweredecreased significantly compared with themodelgroup(P<0.01).The scoresof the X-rays,TD,AD and PTof the rats treated with Qingbi tabletsof high dosagewere lowersignificantly compared with themodelgroup(P<0.01),and therewasno significantdifference of the scores of the X-rays,AIand AD of the rats treated with Qingbi tabletsofhigh dosage compared with positive controlgroup(P>0.05).[Conclusion]The dispelling toxins and dredging collateralsmethod can protectagainst inflammation pathological developmentof CIA rats and relieve inflammatory symptoms.

dispelling toxinsand dredging collateralsmethod;rheumatoid arthritis;collagen-induced arthritis;arthritic symptoms

R593.22

A

1672-1519(2011)03-0234-03

國家自然科學(xué)基金面上項目（30772809）。

劉 維（1962-），女，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事風(fēng)濕病研究工作。

2011-03-20）