李穎豐,周暉登

金黃色葡萄球菌 (SA)是引起院內(nèi)和社區(qū)感染的常見病原菌之一,由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,耐藥菌株迅速增多,耐藥譜不斷變遷;尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)呈高致病性和多重耐藥,且在世界范圍流行,這給臨床抗感染治療帶來極大困難。隨著耐萬古霉素 MRSA的不斷出現(xiàn)[1-2],MRSA感染的流行已引起高度重視和關(guān)注。為了解本地區(qū)兒童感染 SA對(duì)常用抗菌藥物的耐藥及 MRSA流行情況,本研究對(duì)臨床分離 SA兒童株進(jìn)行耐藥模式和 MRSA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài) DNA分型 (RAPD)研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2007年 1月—2009年 12月在廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院住院患兒送檢的痰、血、尿、咽拭子及傷口分泌物等標(biāo)本中分離的 SA共 348株,質(zhì)控菌株 SA AT25923購(gòu)于衛(wèi)生部臨檢中心。

1.2 藥物敏感試驗(yàn) 采用法國(guó)梅里埃 ATB半自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析儀及 GPI藥敏卡進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果判定及質(zhì)量控制按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) (CLSI)2006版標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行,以苯唑西林最低抑菌濃度 (MIC)＞4μg/ml為 MRSA。β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)采用頭孢硝基噻吩顯色法進(jìn)行,紙片變?yōu)榧t色為陽性。

1.3 同源性分析 按試劑盒 (北京賽百盛公司產(chǎn)品)說明書提取 SA染色體 DNA,采用美國(guó) PE公司 5700PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,總反應(yīng)體系為 50μl[10×buffer 5μl,20 mmol/L Mg2+5 μl,10 mmol/L dNTP 1 μl,50 pmol/μl引物 (5-CCG CTA CCGA-3)0.5μl,雙蒸水 36.5μl,模板 2μl],擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性 4 min,94℃變性 60 s、42℃復(fù)性 60 s、72℃延伸 60 s,35個(gè)循環(huán),72℃延伸 5 min。產(chǎn)物經(jīng)含溴化乙錠(EB)的 1.2%瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)電泳條帶確定型別。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 藥敏資料采用 WHONET 5.4軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 SA分布率 檢出 SA的標(biāo)本主要來自新生兒科 37.93%(132株),其次為兒科 PICU 27.01%(94株),呼吸科18.97%(66株),兒外科 10.63%(37株),兒內(nèi)科 5.46%(19株)。各類標(biāo)本中檢出 SA最多的為痰液 42.53%(148株),其次為傷口分泌物 24.14%(84株),血液 13.79%(48株),咽拭子 10.34%(36株),尿液 7.18%(25株),其他2.02%(7株 )。

2.2 SA耐藥性總體情況 348株 SA中,334株產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶,對(duì)青霉素和阿莫西林/棒酸耐藥較高,分別為 100.00%和49.14%;對(duì)其余 β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物耐藥率較低,為6.03%～12.93%。耐藥率較低的有呋喃妥因、利福平、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星,為 3.74%～16.38%;耐藥率較高的有四環(huán)素、復(fù)方新諾明、克林霉素和大環(huán)內(nèi)酯類,為 43.97%～65.23%;未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬古霉素、替考拉林和利奈唑胺耐藥株。具體見表1。

表1 348株 SA對(duì)常用抗菌藥物的耐藥性 (%)Table 1 The antibiotic resistance of 348 isolates staphylococcus aureus

2.3 MRSA與 MSSA耐藥性比較 348株 SA中檢出 MRSA 34株,MRSA、MSSA(甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌)對(duì)青霉素耐藥率均為 100.00%,對(duì)萬古霉素、替考拉林、利奈唑胺、呋喃妥因和利福平耐藥率均較低,為 0～8.82%,而對(duì)其余 17種抗菌藥物耐藥率 MRSA均高于 MSSA。具體見表1。

2.4 MRSA同源性分析 經(jīng) RAPD分型,可見 1～11條基因條帶,共分為 6個(gè)基因型 (見圖1)。其中Ⅰ型 22株,Ⅱ型 5株,Ⅲ型 1株,Ⅳ型 3株,Ⅴ型 2株,Ⅵ型 1株,以Ⅰ型感染為主 (64.71%)。不同 MRSA基因分型的科室分布見表2。

表2 34株 MRSA-RAPD基因分型臨床科室分布Table 2 The clinical distribution of RAPD analyses of 34 Methicillin-resistant staphylococcus aureus

圖1 MRSA-RAPD基因分型圖譜Figur e 1 Fingerprint of RAPDanalyses of MRSA

3 討論

SA能產(chǎn)生多種毒素及酶,是引起臨床感染的重要病原菌。常見的感染有外科切口等局部化膿性感染和肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、膿毒癥等全身感染。本研究結(jié)果顯示,SA主要分離自呼吸道標(biāo)本痰液和咽拭子,其次為傷口分泌物,血液也有較高的檢出率 (13.79%),表明呼吸道仍是本院兒科 SA感染的首發(fā)部位。從分布來看,主要來自新生兒科、兒科 PICU和呼吸科,表明這些科室易發(fā)生 SA感染[4]。其中新生兒科所占比例最高,這與新生兒免疫系統(tǒng)尚未成熟、對(duì)環(huán)境中的 SA高度易感有關(guān)。

耐藥監(jiān)測(cè)顯示,348株 SA未發(fā)現(xiàn)對(duì)糖肽類、噁唑烷酮類代表藥物利奈唑胺耐藥株,表明這些藥物仍是 SA感染重癥患兒治療首選和最有效的藥物。其中利奈唑胺作為一種新藥,臨床在使用時(shí)應(yīng)做好耐藥性監(jiān)測(cè),避免濫用[5]。喹諾酮類、頭孢類、利福平、呋喃妥因的耐藥率也較低,表明這些藥物對(duì)SA有較好的抗菌活性。但喹諾酮類藥物可在 3～4 d內(nèi)產(chǎn)生耐藥,應(yīng)注意耐藥性監(jiān)測(cè)。348株 SA中334株 SA產(chǎn) β-內(nèi)酰胺酶,對(duì)青霉素的耐藥率為100.00%,對(duì)其余 β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率為 6.03%～49.14%。值得注意的是,苯唑西林耐藥率為 9.77%,與頭孢菌素類耐藥率 8.62%～12.93%無差異;表明治療 SA感染頭孢菌素類并不比苯唑西林優(yōu)越,苯唑西林仍是治療兒童 SA感染的敏感藥物。四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類、阿莫西林/棒酸、復(fù)方新諾明和克林霉素耐藥率較高,均大于40%,表明這些藥物不宜用于 SA感染的治療。阿莫西林/棒酸作為 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑,其耐藥率卻遠(yuǎn)高于除青霉素外的β-內(nèi)酰胺類藥物及哌拉西林/他唑巴坦,導(dǎo)致這種差異可能與用藥習(xí)慣相關(guān),是否與耐酶抑制劑廣譜酶 (IRBL)產(chǎn)生有關(guān),還需進(jìn)一步研究。

348株 SA中 MRSA檢出率為 9.77%,與本地區(qū)8.30%[6]、上海 9.7%[7]相近,低于 Mahnarin 2008年度報(bào)告 0～14歲兒童的 32.7%[8],遠(yuǎn)低于 Mohnarin 2008年度報(bào)告的52.3～76.9%[9],表明 MRSA檢出率在不同地區(qū)和人群中差異較大。這可能與不同地區(qū)用藥習(xí)慣不同,病例年齡構(gòu)成、標(biāo)本來源等有關(guān)。本組 348例標(biāo)本均來自住院患兒,新生兒及嬰幼兒所占比例較大,MRSA檢出較低可能與臨床用藥比較謹(jǐn)慎有關(guān)。MRSA對(duì)所有 β-內(nèi)酰胺類藥物均有不同程度耐藥,耐藥率 23.53%～100.00%,這與 MRSA染色體攜帶的 mecA基因編碼與 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物親和力極低的替代性青霉素結(jié)合蛋白有關(guān)。同時(shí) mec基因可整合紅霉素、四環(huán)素等多種耐藥基因,導(dǎo)致其對(duì)紅霉素和四環(huán)素呈高度耐藥性[10]。本研究中MRSA對(duì)四環(huán)素和紅霉素耐藥率均高達(dá) 82.35%,其中對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類 3種抗菌藥物同時(shí)耐藥。對(duì)萬古霉素、替考拉林、利奈唑胺、呋喃妥因和利福平耐藥率與 MSSA無差異,對(duì)其余抗菌藥物耐藥率均高于 MSSA。

近年來,MRSA引起的嚴(yán)重感染在全球范圍內(nèi)迅速增加,常有暴發(fā)流行的報(bào)道。因此,如何有效預(yù)防和控制 MRSA感染已迫在眉睫。目前主要應(yīng)用 RAPD和脈沖場(chǎng)電泳對(duì)細(xì)菌進(jìn)行基因分型,以了解其流行情況。RAPD是通過 PCR介導(dǎo)使所有與隨機(jī)引物互補(bǔ)的模板基因組 DNA得到擴(kuò)增,產(chǎn)生一系列大小不同的 DNA片段,經(jīng)電泳呈現(xiàn)出不同的 DNA指紋圖進(jìn)行分型。脈沖場(chǎng)電泳被視為細(xì)菌基因分型的金標(biāo)準(zhǔn),分辨力高,且易標(biāo)準(zhǔn)化;但樣本制備繁瑣,且需要特殊的電泳儀器,電泳耗時(shí)長(zhǎng)。而 RAPD方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速、靈敏,最大特點(diǎn)在于靶基因序列未知情況下設(shè)計(jì)任意 10個(gè)堿基單鏈寡聚核苷酸片段引物,其分型結(jié)果與脈沖場(chǎng)電泳基本一致,可作為細(xì)菌分子生物學(xué)流行病學(xué)研究的可靠方法。

本研究應(yīng)用 RAPD方法對(duì)分離的 34株 MRSA進(jìn)行基因分型,共分為 6個(gè)基因型,其中以Ⅰ型感染為主 (64.71%)。兒科 PICU分離的 MRSA菌株最多,以Ⅰ型感染為主。研究發(fā)現(xiàn)該病區(qū)存在 MRSA暴發(fā)[11],暴發(fā)病例為 6例,且存在 2個(gè)基因型的 MRSA流行;聚集性病例為3例,其余均為散發(fā)性病例,這主要與 ICU患兒住院時(shí)間較長(zhǎng)、侵襲性操作、使用抗菌藥物、合并感染和其他神經(jīng)癥狀等均大大增加了感染 MRSA的幾率[12]。新生兒科、呼吸科、兒外科和兒內(nèi)科分離得 MRSA菌株較少,且分布也較分散;但除有各自不同的基因型外,還存在與兒科 PICU相同的基因型,可能上述科室與兒科 PICU間時(shí)有患兒轉(zhuǎn)入或轉(zhuǎn)出有關(guān)。

總之,在對(duì)感染 SA患兒抗感染治療的同時(shí),應(yīng)加強(qiáng)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè),及時(shí)掌握耐藥性變遷,正確、合理地使用抗菌藥物,是預(yù)防耐藥性進(jìn)一步蔓延的有效措施。同時(shí),采用 RAPD方法對(duì) MRSA進(jìn)行同源性分析,對(duì)有效控制醫(yī)院感染、確定MRSA引起的感染暴發(fā)及其傳播途徑有重要意義。

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