王彥永，馬 琳，馬曉偉，馬芹穎，顧 平，王銘維

經顱磁刺激 (transcranial magnetic stimulation，TMS)技術為國內外研究的熱點，TMS可在腦深部產生感應生物電流，從而影響相應腦神經元電活動和局部功能的一種無創(chuàng)的物理治療方法。臨床研究發(fā)現帕金森病 (Parkinson's disease，PD)患者經TMS治療后其動作反應時間及運動靈活性均有顯著改善［1］，統(tǒng)一帕金森病評分量表 (UPDRS)評定癥狀有明顯的好轉［2-3］。動物實驗表明，TMS可促進腦缺血大鼠神經元增殖［4］。本研究觀察了磁刺激作用后原代培養(yǎng)的神經元的突起及形態(tài)改變，初步探討磁刺激影響神經元生長發(fā)育的可能機制，為臨床上應用經顱磁刺激治療神經系統(tǒng)疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和動物 B27添加劑、DMEM/F12(1∶1)、neurobasal培養(yǎng)液和DMEM為Gibco公司產品。胎牛血清為杭州四季青公司產品。堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、Hoechst33258、膠質纖維酸性蛋白 (GFAP)、抗微管相關蛋白-2(microtubule associated protein 2，MAP-2)抗體和FITC標記的抗小鼠IgG抗體購于Sigma公司。成年和新生SD大鼠均購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 海馬神經元原代混合培養(yǎng) 取昆明新生小鼠，浸泡在750 ml/L乙醇中消毒后，放在一次性無菌濾紙上，剪下鼠腦，剝出完整的腦組織，放在預冷的解剖液中分離海馬。將所取組織剪碎后用1.25 g/L胰酶，37℃消化10～15 min，用含10 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。用火焰拋光的玻璃吸管反復吹打后靜置，待組織塊沉淀后吸取上清，反復5次后將收集的上清液以800 r/min離心5 min，棄上清后加入含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液，接種到預先用多聚賴氨酸包被的35 mm小培養(yǎng)皿中。將細胞培養(yǎng)在含50 ml/L CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。過夜后，將培養(yǎng)液更換為含20 ml/L B27的neurobasal無血清培養(yǎng)液，3 d后換液，培養(yǎng)6 d的細胞用于實驗。

1.3 實驗分組 實驗分為4組:(1)正常組 (Contorl，C):在37℃CO2孵育箱中正常培養(yǎng)。 (2)假刺激組 (Shame，S):暴露于磁場環(huán)境，但不接受磁刺激。(3)40%最大刺激強度組 (40%of maximum intensity of stimulation，M1):利用40%的磁場最大刺激強度 (約0.76 T)作用于細胞。 (4)60%最大刺激強度組 (60%of maximum intensity of stimulation，M2):利用60%的磁場最大刺激強度 (約1.14 T)作用于細胞。

1.4 磁刺激干預 磁刺激干預開始于細胞種于培養(yǎng)皿24 h后，于每日同一時間刺激細胞。每日刺激3組，每組20序列，每個序列間隔1 s，每組間隔1 min，連續(xù)刺激5 d。刺激頻率為1 Hz，刺激強度參照實驗分組。每次對細胞實施磁刺激時磁頭距細胞約1.0 cm。實驗中應用的磁刺激儀為英國產的Magstim22型磁刺激儀，頻率為1 Hz，最大輸出強度為1.9 T，磁頭直徑9 cm。

1.5 細胞免疫熒光染色 培養(yǎng)的細胞首先用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)漂洗，用新鮮配置的40 g/L多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS洗滌后用10 ml/L的過氧化氫清除內源性過氧化物酶10 min;3 ml/L Triton作用20 min，室溫下用山羊血清封閉20 min;加入map22抗體 (Neomarker，1∶200)4℃過夜;PBS洗滌后加入FITC標記的二抗 (1∶100)室溫1 h，為明確神經元總數，Hoechst33258(10μg/ml)復染胞核;每步驟間均經0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。每次行免疫細胞化學染色時，均設1張陰性對照，即一抗由PBS代替，其余染色過程相同。最后置于Nikon倒置熒光顯微鏡(TE2000-U型)下觀察，CCD(Nikon digital camera DXM-1200F)采樣。每孔隨機選擇15個視野在200倍下對MAP-2陽性細胞進行計數，每一時間點均做3個復孔。使用倒置熒光顯微鏡 (Nikon TE2000)觀察MAP-2陽性細胞形態(tài)。

1.6 細胞突起計數 在倒置熒光顯微鏡下每孔以“之”字形由上而下隨機選擇15個不同的視野，使最終計得的細胞總數不少于600個。使用ACT-1軟件采樣，應用Image Pro-Plus軟件計數MAP-2陽性細胞的突起數及突起長度，細胞突起長度以待測細胞自身胞體最大直徑為測量單位，并通過計數Hochest33258標記明確的MAP-2陽性細胞總數，然后計算不同突起個數的神經元及不同突起長度的神經元在總神經元中所占的比例。為保證采集圖像的質量，每次實驗均根據陰性對照結果調節(jié)曝光時間。各組實驗獨立重復3次，進行相同的計數過程，但由于海馬神經元為大錐體神經元，培養(yǎng)6 d后突起生長較長且細胞與細胞聯系較為密切，所以本實驗結果中未統(tǒng)計海馬原代神經元的突起長度。

1.7 逆轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)

1.7.1 引物設計 根據Gene Bank的cDNA序列經Primer 5.0軟件設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。實驗中涉及的引物如下:目的基因為編碼SYN-I的基因，其上游引物序列為5'-TTCTTCGGA ATG GAG TCA AA-3'，下游引物序列為5'-TGC TTG TCT TCA TCC TGG TG-3'，擴增片段長度為711 bp;GAP-43的上游引物序列為5'-CGA GAA AGA TCC CAA GTC CA-3'，下游引物序列為5'-GAA CGG AAC ATT GCA CAC AC-3'，擴增片段長度為206 bp;β-actin的上游引物序列為5'-TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG-3'，下游引物序列為5'-TCCTCCCTG GAG AAG AGCTA-3'，擴增片段長度為301 bp。

1.7.2 總RNA的提取與測定 棄去培養(yǎng)基，采用TRizol試劑一步法提取總的RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量，紫外投射儀觀察，可見18 S和28 S兩條RNA條帶。取2μl RNA溶液用紫外分光光度計測定吸光度值 (OD值，OD260/OD280≥1.8)。總RNA 量 =OD260×40(ml/L) × 體積 (L)。校正各組總RNA濃度。

1.7.3 RT-PCR 取1μg總 RNA，加入4μl逆轉錄緩沖液(10×)，2μl dNTP混合液，1μl RNA酶抑制劑，1μl逆轉錄酶，MgCl24 μl，5 × RT-buffer 4 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，20 μmol/L RNasin 0.25 μl，M-MLV 0.75 μl，OligvdT 1 μl引物，再加DEPC水補足到20μl，42℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃ 5 min，得到的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應體系(50μl):逆轉錄緩沖液 (10×)5μl，dNTP 1μl，MgCl25 μl，上游引物P1 5μl，下游引物P2 5μl，DNA聚合酶1 U，反轉錄產物1μl，加去DEPC水至50μl。將上述各組分混合均勻，按照如下反應條件進行PCR擴增:預變性94℃2 min，變性94℃ 30 s，退火55℃ 40 s，延伸72℃ 1 min，經過35個循環(huán)后72℃ 15 min。PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 TMS對海馬原代神經元突起形態(tài)的影響 實驗中連續(xù)觀察發(fā)現:TMS 24 h與48 h時可見細胞均勻分布在培養(yǎng)皿上，小部分細胞可見短小突起，各組之間無明顯差別。TMS 72 h后觀察見細胞生長狀態(tài)良好，與C組和S組比較，M1、M2組細胞突起較長，細胞與細胞間聯系較多，部分細胞表現為多突起生長。TMS 5 d后觀察細胞與細胞間網狀連接更加明顯，鏡下已不能明確觀察各組間差別 (見圖1)。

2.2 各組海馬原代神經元突起數計數 TMS 5 d后計數，含有2個突起的神經元占總神經元的比例4組間比較，差異有統(tǒng)計學意義 (F=0.008，p＜0.05)，M1組、M2組含有2個突起的神經元占總神經元的比例較C組和S組明顯增多;含有3個及3個以上突起的神經元占總神經元的比例4組間比較，差異有統(tǒng)計學意義 (F=0.011，p＜0.05)，M1組、M2組含有3個及3個以上突起的神經元占總神經元的比例較C組和S組明顯增多 (p＜0.05，見表1)。

2.3 TMS對海馬原代神經元SYN-I mRNA表達的影響 M2組的SYN-I mRNA表達與C、S兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);而M1組SYN-I mRNA表達雖然與各組間表達有一定的不同，但差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見圖2)。

圖1 各組海馬神經經元突起生長的觀察 (200×)Figure 1 The growth state of hippocampus neurons in each group(C:control group;S:shame group;M1:M1 group;M2:M2 group)

表1 經顱磁刺激對原代培養(yǎng)海馬神經元突起生長的影響(x—±s，%)Table 1 The effect of hippocampus neurons percentage after 5 days by transcranial magnetic stimulation

圖2 TMS對海馬原代神經元SYN-I mRNA表達的影響Figure 2 SYN-ⅠmRNA expression in the hippocampus(C:controlgroup，S:shame group，M1:M1 group，M2:M2 group)

3 討論

TMS是在強大電磁場作用下，在腦深部產生感應生物電流，從而影響相應腦神經元電活動和局部功能的一種無痛、無損傷、操作簡便、安全可靠的生物學技術，由Barker等［5］在1985年首先創(chuàng)立。在20多年的發(fā)展中，TMS的臨床應用研究一直集中在治療精神心理疾病和神經退行性疾?。?］。通過調節(jié)頻率、強度、刺激間歇和刺激時間對中樞神經系統(tǒng)的功能產生不同的影響，因而對中樞及外周神經系統(tǒng)疾病具有治療作用［7］。那么，TMS對于神經元的發(fā)育突起生長、突觸的建立與穩(wěn)定是否具有促進作用?本實驗室前期研究利用頻率為1 Hz的低頻磁刺激干預對數生長期的PC12細胞，發(fā)現磁刺激作用后PC12細胞突起生長明顯增多以及多巴胺 (DA)分泌增加［8］;動物實驗還發(fā)現TMS作用于MPTP誘導的PD小鼠能夠增加紋狀體GAP-43和Syp表達［9］，提示TMS有促進神經再生和突觸重塑作用。那么，TMS對于體外培養(yǎng)的原代神經元是否具有相同的作用?

本實驗以強度為0.76 T和1.14 T、頻率為1 Hz的磁場作用于原代培養(yǎng)的海馬神經元，利用免疫熒光化學染色方法觀察神經元突起生長情況。TMS作用后觀察發(fā)現M1、M2組的神經元突起數目均較C、S組明顯增多，說明該參數下的磁刺激有促進海馬原代神經元突起生長的作用。我們設想TMS對突觸的形成及穩(wěn)定有無促進作用。突觸蛋白 (Synapsin，SYN)作為軸突終末端的突觸前囊泡膜上的特異性的鈣結合糖蛋白，是一種重要的囊泡膜標志蛋白［10］，它通過磷酸化控制神經末梢釋放突觸囊泡的數量、參與神經遞質的釋放及突觸囊泡的循環(huán)，在神經元的發(fā)育中起重要作用［11］。目前研究較多的SYN-I是1972年Johnson等發(fā)現的突觸蛋白家族的第一個成員。SYN的主要功能為:(1)參與神經遞質的釋放及突觸囊泡的循環(huán)［12］;(2)對突觸的發(fā)育有重要作用［13］;(3)參與調節(jié)神經軸突的延伸［14］。本實驗中利用RT-PCR檢測原代神經元SYN-I mRNA表達發(fā)現，在海馬原代神經元M2組的SYN-I mRNA表達明顯多于其他各組;而M1組的SYN-I mRNA表達雖然比C、S組多，但在統(tǒng)計學上無明顯差異;結合免疫熒光化學染色對細胞的觀察分析:(1)本實驗中的兩種磁場強度在一定程度上都可以促進海馬及中腦原代神經元的突起生長，并且這種促生長作用與磁場強度有一定的關系。有研究表明TMS可促進腦卒中后梗死周邊區(qū)GAP43和SYN的表達［4］，這都提示TMS有促進神經再生及促進突觸再建和增強、完善再建突觸效能的作用。(2)在本實驗中僅M2組SYN-I表達較其他組有意義，M1組SYN-I較未接受磁刺激組無明顯改變，而細胞突起的形態(tài)學上有所改變，所以考慮可能為實驗中M1組磁場強度尚不足引起SYN-I mRNA表達的變化以及其他因素同樣參與了調節(jié)神經元突起的生長。Kim等［15］觀察了恒磁場對神經元培養(yǎng)的影響及在磁場作用下對新生的軸突方向性的影響，發(fā)現磁場作用5 d后的細胞突起較未刺激組細長且筆直，并且突起生長方向為垂直磁場方向，但未發(fā)現細胞骨架蛋白及突觸蛋白表達水平的改變。因此，磁刺激作用于細胞所產生的一系列效應并不是單一因素所引起，它所產生的效應與刺激參數和被刺激細胞功能狀態(tài)有關;SYN在MS作用后的神經元突觸延伸過程中的不同階段發(fā)揮著一定的作用。這種作用的確切機制尚需在以后的研究中進行深入的探討。

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