楊煥東，楊桂蓮，張春元，張春梅，王慎田

血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)和內(nèi)皮抑素 (endostatin)分別是目前已知的作用最強的血管生成促進因子和抑制因子，深入研究兩者在腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移中的作用及手術(shù)前后的變化規(guī)律，對腫瘤早期診斷和判斷預(yù)后具有重要的臨床意義。關(guān)于原發(fā)性肝癌二者聯(lián)合檢測的意義未見報道。本研究采用ELISA法測定原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平，并以慢性乙型肝炎肝硬化和健康人群作為對照，探討血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平的變化及其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2005年3月—2009年3月在濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院消化科和普外科收治的原發(fā)性肝癌患者163例 (肝癌組)，多屬于中、晚期，其中男112例，女51例;年齡28～69，平均 (53.2±10.5)歲。根據(jù)臨床癥狀和體征、B超、CT、腫瘤標志物確診，部分病例術(shù)后經(jīng)病理切片進一步診斷。另選取同期慢性乙型肝炎肝硬化患者75例 (肝硬化組)，其中男59例，女16例;年齡33～67歲，平均 (54.8±9.6)歲。同期健康志愿者及健康查體檢者60例 (正常對照組)，其中男42例，女18例;年齡24～71歲，平均 (52.3±11.2)歲。試驗前對所有受試者履行知情同意告知并獲同意后入選本試驗。

1.2 方法 所有患者于入院后未治療前清晨空腹 (健康人群則隨機清晨空腹)抽取外周靜脈血4 ml，室溫放置30～60 min后3 000 r/min離心10 min，分離并留取血清置-70℃低溫冷凍備用。部分手術(shù)和 (或)介入治療的患者于術(shù)后2周同法收集血清冷凍備用。用ELISA法測定血清VEGF及內(nèi)皮抑素水平，檢測方法嚴格按試劑盒說明書進行。全自動酶標儀測定光密度值 (D值)，VEGF檢測波長為450 nm，內(nèi)皮抑素檢測波長為490 nm。繪制標準曲線，通過標本的D值在標準曲線上查出其對應(yīng)濃度。人VEGF ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，人內(nèi)皮抑素ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以表示，各組間均數(shù)比較用t檢驗或方差分析。p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受檢者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較 肝癌組患者術(shù)前血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平均顯著高于肝硬化組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.01);而肝硬化組與正常對照組血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05，見表1)。

2.2 原發(fā)性肝癌患者血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平與臨床特點及分期之間的關(guān)系 不同性別、是否合并肝硬化的原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。腫瘤直徑＜5 cm者血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平顯著低于腫瘤直徑＞5 cm者，有門靜脈癌栓的原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平顯著高于無靜脈癌栓的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.01)。TNMⅠ、Ⅱ期的原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);但當(dāng)腫瘤發(fā)展到Ⅲ、Ⅳ期時，血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平顯著升高，與Ⅰ、Ⅱ期比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.01，見表2)。

表1 肝癌組、肝硬化組、正常對照組血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較(，ng/L)Table 1 The comparison of serum VEGF and endostatin level in hepatocellular carcinoma group，posthepatitic cirrhosis group and control group

表1 肝癌組、肝硬化組、正常對照組血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平比較(，ng/L)Table 1 The comparison of serum VEGF and endostatin level in hepatocellular carcinoma group，posthepatitic cirrhosis group and control group

注:與肝硬化組及正常對照組比較，*p＜0.01

組別 例數(shù) VEGF 內(nèi)皮抑素肝癌組 163 412.3 ±145.6* 45.6 ±11.7*肝硬化組 75 168.5 ± 72.4 33.2 ± 9.6正常對照組 60 164.6 ± 68.5 31.4 ±10.4 F 值＜0.01 ＜0.01 11.7 8.4 P值

表2 原發(fā)性肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平與臨床特點及分期之間的關(guān)系Table 2 Relationship between serum VEGF and endostatin levels and clinicopathologic features in hepatocellular carcinoma

2.3 原發(fā)性肝癌患者術(shù)前術(shù)后血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平的變化 107例肝癌患者行外科和 (或)介入手術(shù)治療，術(shù)前血清VEGF水平為 (388.4±124.2)ng/L，術(shù)后 2周下降為(213.5±98.3)ng/L;術(shù)前血清內(nèi)皮抑素水平為 (42.5±10.4)ng/L，術(shù)后 2 周明顯升高，為 (53.8 ±11.9)ng/L。術(shù)前、術(shù)后VEGF、內(nèi)皮抑素水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為11.45 和7.40，P ＜0.01)。

2.4 血清VEGF水平和內(nèi)皮抑素水平之間的相關(guān)性 肝癌組患者術(shù)前內(nèi)皮抑素水平與VEGF水平呈正相關(guān) (r=0.658，p＜0.01)，而肝硬化組和正常對照組受檢者內(nèi)皮抑素水平與VEGF水平無相關(guān)性 (r值分別為0.178和0.087，P＞0.05)。

3 討論

腫瘤血管新生是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。新生血管不僅為腫瘤生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧以及排出代謝廢物，并為腫瘤細胞進入血液循環(huán)和轉(zhuǎn)移提供可能，因此血管生成在腫瘤形成以及以后的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著極為重要的作用，是腫瘤得以迅速生長和發(fā)展的關(guān)鍵［1］。腫瘤血管生成是一個多基因、多因子參與的過程，在這一過程中腫瘤細胞不僅能分泌許多種促進血管形成、加速腫瘤發(fā)展的因子，同時也能分泌許多抑制血管形成、促使腫瘤消退、凋亡、防止轉(zhuǎn)移的因子［2-3］。該過程受到“血管生成開關(guān)”系統(tǒng)精密調(diào)控，使血管生成刺激因子和抑制因子保持平衡［4］。腫瘤生長還是消減取決于促進血管生長因子和抑制血管生長因子含量的變化［5］。VEGF是目前已知的作用最強、特異性最高的血管生成調(diào)控因子［6］，它不僅能與位于血管、淋巴管內(nèi)皮細胞表面的受體結(jié)合，通過調(diào)節(jié)血管和淋巴管的生成、增加其通透性而促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，還能通過自分泌途徑與腫瘤細胞表面的受體相結(jié)合，直接促進腫瘤生長［7］。近年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮抑素則被認為是迄今為止最有效的內(nèi)源性血管生長抑制因子之一［8］。體外和動物實驗表明內(nèi)皮抑素及其類似物在體外能有效抑制內(nèi)皮細胞的生長、移行，在體內(nèi)顯著退縮和停滯原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的生長［8］。內(nèi)皮抑素可競爭性阻斷VEGF誘導(dǎo)血管生成的信號傳導(dǎo)通路，減少血管內(nèi)皮細胞膜VEGF受體的數(shù)量，降低體內(nèi)VEGF mRNA水平表達［9］。內(nèi)皮抑素和VEGF的作用相互拮抗，共同影響腫瘤新生血管的生成。有關(guān)聯(lián)合檢測肝癌患者血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平及其手術(shù)前后動態(tài)變化的研究未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者術(shù)前血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平均顯著高于良性病變慢性乙型肝炎患者和健康者，與Kuroi等［10］的研究結(jié)果一致，表明肝癌細胞確能分泌大量的VEGF，促進腫瘤血管生成，以提供腫瘤細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)并為腫瘤轉(zhuǎn)移提供條件。同時，腫瘤組織通過多種途徑刺激機體產(chǎn)生大量內(nèi)皮抑素，經(jīng)血液循環(huán)到達腫瘤部位，抑制原發(fā)和繼發(fā)腫瘤血管的生成，與血管生成促進因子的作用相拮抗，達到一種平衡。

本研究觀察到，肝癌患者術(shù)前血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平與原發(fā)腫瘤大小、有無門靜脈癌栓以及臨床病理分期密切相關(guān)，而且術(shù)前血清VEGF和內(nèi)皮抑素水平呈明顯正相關(guān)。隨著腫瘤增大，血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平明顯升高。隨著腫瘤分期的不斷進展，血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平亦不斷升高，Ⅲ期和Ⅳ期肝癌患者的血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者。說明隨著惡性程度的升高，腫瘤分泌VEGF、內(nèi)皮抑素均增加，但兩者增加的程度可能并不平行，加之腫瘤組織還可產(chǎn)生其他血管生成促進因子和抑制因子，使得“血管生成開關(guān)”處于開放狀態(tài)，促血管生成效應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢，惡性腫瘤得以無限制地生長、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。有研究表明快速生長的癌組織極易出現(xiàn)缺血缺氧，導(dǎo)致VEGF大量分泌，以加速血管內(nèi)皮細胞的增殖和分化，促使新生血管生成，從而滿足腫瘤生長的需求。腫瘤的惡性程度越高，對氧的需求越高，VEGF的分泌也越多。同時，隨腫瘤惡性程度增高，蛋白水解酶分泌增加，降解血管基底膜中的膠原蛋白，使內(nèi)皮抑素的生成也相應(yīng)增加［11-12］。本研究認為，術(shù)前血清VEGF、內(nèi)皮抑素水平可反映腫瘤部位的血管增生程度及體內(nèi)腫瘤負荷的大小，作為評價肝癌惡性程度及進展程度的指標，并有可能作為抗血管治療的效應(yīng)指標。

本研究結(jié)果顯示，肝癌患者行手術(shù)治療后血清VEGF水平較術(shù)前均有明顯降低，而內(nèi)皮抑素水平則較術(shù)前升高。提示作為有效的治療手段，根治性手術(shù)的“去腫瘤負荷作用”解除了腫瘤對機體的浸潤及血管生成的影響，使得腫瘤新生血管生成減少，在一定程度上減緩了腫瘤的進展，可作為判斷手術(shù)療效及預(yù)后的指標。

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8 Faye C，Chautard E，Olsen BR，et al.The first draft of the endostatin interaction network ［J］.J Biol Chem，2009，284(33):22041-22047.

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11 Feldman AL，Alexander HR Jr，Bartlett DL，et al.A prospective analysis of plasma endostatin levels in colorectal cancer patients with liver metastases ［J］.Ann Surg Oncol，2001，8(9):741-745.

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