許文集，莊瑛瑛，陳玉麗，莊則豪，王承黨

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，一般認(rèn)為其發(fā)生是一個多因素參與、多階段演進(jìn)的過程。目前認(rèn)為，慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是胃腺癌 (gastric adenocarcinoma，GAC)的癌前期狀態(tài)，腸上皮化生 (intestinal metaplasia，IM)和異型增生 (dysplasia，Dys)是GAC重要的癌前期病變。然而，其確切的發(fā)生機(jī)制尚未闡明。Paxillin是一種黏著斑相關(guān)蛋白，主要存在于黏著斑，而黏著斑是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix，ECM)的接觸點，構(gòu)成ECM與細(xì)胞骨架聯(lián)系的紐帶，也是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要部位，促進(jìn)信號從胞外基質(zhì)經(jīng)整合素途徑向細(xì)胞內(nèi)傳遞［1］。多項研究已表明Paxillin有參與動態(tài)調(diào)節(jié)黏著斑、調(diào)節(jié)細(xì)胞移動和播散等功能［2－3］，陽性表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)［4］，改變Paxillin的磷酸化狀態(tài)，足以關(guān)鍵性地調(diào)控細(xì)胞的遷移［5］。

本研究通過應(yīng)用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶 (S－P)染色方法檢測Paxillin在GAC及癌前期變化(CAG、IM、Dys)組織中的表達(dá)情況，并以慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG)組織作為對照，探討Paxillin在GAC發(fā)生、發(fā)展中的作用以及其與GAC病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例來源

1.1.1 GAC組 選自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2005年6—12月間經(jīng)手術(shù)切除、病理確診、剔除術(shù)前接受過化療或放療的GAC組織標(biāo)本59例，其中男50例，女9例;年齡37～81歲。按世界衛(wèi)生組織 (WHO)腫瘤病理學(xué)與遺傳學(xué)分類GAC的組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)，高分化GAC 9例，中分化GAC 25例，低分化GAC 25例;早期GAC 9例，進(jìn)展期GAC 50例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。

1.1.2 CSG組及癌前期變化組 連續(xù)選取本院同期胃鏡下活檢且經(jīng)病理確診的組織標(biāo)本，輕度CSG 30例，其中男14例，女16例;年齡21～68歲。中度CAG 30例，其中男19例，女11例;年齡21～73歲。中重度IM 30例，其中男14例，女16例;年齡24～68歲。中重度Dys20例，其中男17例，女3例;年齡32～77歲。

1.2 試劑 鼠抗人Paxillin單克隆抗體 (產(chǎn)品編號:Clone 5H11):NeoMarkers產(chǎn)品，工作濃度1∶200。免疫組化染色超敏試劑盒 (產(chǎn)品編號:LHK611抗小鼠)(含S－P免疫組化染色試劑與DAB顯色劑)，購自深圳晶美生物工程有限公司。磷酸鹽緩沖液 (PBS緩沖液，0.01 mol/L，pH=7.4)和枸櫞酸鹽緩沖液 (Citrate抗原修復(fù)液，0.01 mol/L，pH=6.0)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用雙蒸水配制。

1.3 實驗方法 所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm連續(xù)切片，貼于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60℃烤箱過夜，保存于4℃冰箱中。采用免疫組織化學(xué)S－P染色方法檢測Paxillin，操作按說明書進(jìn)行。陽性對照分別由購買相應(yīng)抗體的試劑公司提供，同時用PBS替代第一抗體作陰性對照。采用OLYMPUS BH－2光學(xué)顯微鏡 (OLYMPUS Co.)、Motic圖像分析儀 (北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司)觀察并攝片。

1.4 實驗結(jié)果判斷與圖像分析 光鏡下雙盲閱片，獨立觀察每張切片5個具有代表性的高倍視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞。具體判斷標(biāo)準(zhǔn)如下:Paxillin定位于細(xì)胞質(zhì)和 (或)細(xì)胞膜，以細(xì)胞質(zhì)和 (或)細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽性信號。(1)根據(jù)染色程度進(jìn)行評分:染色強(qiáng)度弱者 (淡黃色或僅個別細(xì)胞呈黃至棕黃色染色)為1分，染色強(qiáng)度強(qiáng)者 (呈黃至棕黃色染色)為3分，染色強(qiáng)度中等者 (染色強(qiáng)度介于弱者和強(qiáng)者之間)為2分;(2)根據(jù)著色細(xì)胞百分率進(jìn)行評分:著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分率＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分。將每張切片染色強(qiáng)度得分與著色細(xì)胞百分率得分各自相乘，為其最后得分。得0～1分為陰性 (－)，得2～3分為弱陽性 (+)，得4～5分為中等陽性 (++)，≥6分為強(qiáng)陽性 (+++)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用非參數(shù)檢驗及等級資料Spearman秩相關(guān)分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Paxillin在腺癌細(xì)胞胞質(zhì)均呈彌漫性中等至強(qiáng)陽性染色，CSG細(xì)胞僅胞膜淡染，與CSG組相比，CAG組、IM組、Dys組及GAC組中Paxillin表達(dá)均有不同程度的增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.05);與GAC組相比，CAG組、IM組及Dys組中Paxillin表達(dá)均較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.05);而IM組與Dys組間Paxillin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);Paxillin表達(dá)程度和胃黏膜病變程度呈正相關(guān) (rs=0.779，P=0.000)，隨胃黏膜病變程度的加重，Paxillin表達(dá)逐漸增強(qiáng)(見表1，圖1～6)。

表1 Paxillin在GAC、癌前期變化及CSG中的表達(dá)［n(%)］Table 1 The expression of Paxillin in GAC，preneoplastic changes and CSG groups

圖1 CSG細(xì)胞膜淡染 (×400)Figure 1 Only light staining was found in CSGcells

圖2 CAG細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)不均勻染色 (×400)Figure2 Asymmetrical staining was found in CAGcells

圖3 IM細(xì)胞彌漫染色 (×400)Figure3 Moderately staining was found in IM cells

圖4 Dys細(xì)胞彌漫染色 (×400)Figure 4 Moderately staining was found in Dys cells

圖5 高分化GAC細(xì)胞彌漫較強(qiáng)染色 (×400)Figur e5 St r ongl yandasyst emat icst ainingwasf oundinwel l－dif f er ent iat edGACcel l s

圖6 低分化GAC細(xì)胞彌漫強(qiáng)染色 (×400)Figure6 St rongl yandasystemat icst ainingwasf oundinpoor－dif f er entiat edGACcel l s

2.2 進(jìn)展期及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移GAC組中Paxillin表達(dá)程度高于早期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移GAC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.05);高分化、中分化和低分化GAC組間Paxillin表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.05)，其中中分化和低分化GAC組間Paxillin表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，中、低分化組Paxillin表達(dá)高于高分化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (p＜0.05，見表2)。

表2 Paxillin表達(dá)程度與GAC病程的關(guān)系［n(%)］Table 2 The expression of Paxillin in different degrees of gastricmucosal lesions

3 討論

本研究結(jié)果顯示，Paxillin在CSG組中已有表達(dá)，且隨著胃黏膜病變程度的加重，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在GAC組中表達(dá)最強(qiáng)，59例GAC癌細(xì)胞胞質(zhì)均呈彌漫性中等至強(qiáng)陽性著色，正常細(xì)胞為胞膜淡染，表明腺癌細(xì)胞中Paxillin不僅表達(dá)增高，而且在細(xì)胞內(nèi)的分布和傳輸也發(fā)生了改變。由于Paxillin可與病毒癌基因v－Src蛋白、v－Crk蛋白和BCR/ABL癌性融合蛋白等多種致瘤性蛋白結(jié)合，擾亂、甚至誤導(dǎo)正常黏附和控制細(xì)胞增殖所需的生長因子信號級聯(lián)反應(yīng)［6］，因此，GAC演化過程中Paxillin的表達(dá)異?？赡苁且环N不可忽視的分子事件，其表達(dá)上調(diào)可能為組織惡性轉(zhuǎn)化的早期標(biāo)志，且其影響可能持續(xù)至GAC階段。本研究結(jié)果顯示，中分化和低分化GAC組中Paxillin表達(dá)顯著高于高分化GAC組，田素芳等［7］在GAC中也觀察到同樣的結(jié)果，表明Paxillin作用持續(xù)到GAC階段，且與GAC的分化有一定的關(guān)系，但確切的作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期和伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移GAC組中Paxillin表達(dá)顯著高于早期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移GAC組。研究已發(fā)現(xiàn)，在高轉(zhuǎn)移潛能乳腺癌細(xì)胞中Paxillin在基因和蛋白水平的表達(dá)均高于低轉(zhuǎn)移潛能乳腺癌細(xì)胞，高轉(zhuǎn)移潛能乳腺癌細(xì)胞的黏附率高于低轉(zhuǎn)移潛能乳腺癌細(xì)胞［8］;肝細(xì)胞癌患者中Paxillin的陽性率在低分化組高于高分化組，伴有門靜脈癌栓形成組高于無癌栓形成組，伴有肝外轉(zhuǎn)移組高于無肝外轉(zhuǎn)移組［9］，與本研究相符，提示癌組織中Paxillin表達(dá)升高與GAC的轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能使GAC細(xì)胞運(yùn)動能力增強(qiáng)，與其周圍的非腫瘤細(xì)胞之間的局部黏附作用加強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生侵襲和遷移，進(jìn)而形成轉(zhuǎn)移。

研究表明當(dāng)Paxillin表達(dá)低下或缺失時，細(xì)胞形態(tài)變圓，影響細(xì)胞的扁平及絲狀偽足形成，細(xì)胞黏附能力下降，在培養(yǎng)基中擴(kuò)散運(yùn)動能力下降［10］。該基因缺失的成纖維細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞遷移能力缺陷，表明Paxillin具有控制細(xì)胞播散和移動的能力［2］。Paxillin過表達(dá)或磷酸化可使SCC25舌磷狀細(xì)胞癌細(xì)胞遷移、黏附能力增強(qiáng)［11］，使無侵襲性的乳腺癌細(xì)胞向有侵襲性表型轉(zhuǎn)化［4］。最新體外研究表明，胃癌細(xì)胞系的侵襲力與纖維連接蛋白和Paxillin酪氨酸118(tyr118)磷酸化呈正比，通過siRNA沉默Paxillin tyr118磷酸化，纖維連接蛋白刺激的該細(xì)胞系侵襲力也受抑制，Paxillin是纖維連接蛋白刺激胃癌細(xì)胞系侵襲的重要因子［12］。Chen等［13］發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤激酶Brk促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞的遷移和侵襲是Paxillin磷酸化引起的，Paxillin是Brk的結(jié)合蛋白和作用底物，EGF激活Brk的催化活性，Brk再磷酸化 Paxillin的 Y31和 Y118，通過適配蛋白(CrkII)激活鳥苷三磷酸酶Rac1(GTPase Rac1)，從而引起細(xì)胞侵襲和遷移。其絲氨酸磷酸化也參與細(xì)胞移動作用。肝細(xì)胞生長因子促進(jìn)上皮細(xì)胞鋪展和遷移的過程是通過ERK磷酸化Paxillin的S83實現(xiàn)的［14］。抑制蛋白磷酸酶2A(PP－2A)導(dǎo)致Lewis肺癌細(xì)胞系細(xì)胞變圓、增加細(xì)胞的運(yùn)動性，這過程中伴隨著Paxillin絲氨酸磷酸化增加和酪氨酸磷酸化減少［15］。Petit等［5］認(rèn)為膠原蛋白誘導(dǎo)的NBT－II膀胱癌細(xì)胞的黏附和伸展均與Paxillin的酪氨酸磷酸化有關(guān)，如果把其分子中兩個最主要的酪氨酸Y31和Y118突變?yōu)楸奖彼岵⒃诩?xì)胞中過表達(dá)，則可以有效抑制細(xì)胞的運(yùn)動，而細(xì)胞附著和鋪展并未受到影響。本研究在蛋白水平提示Paxillin可能參與GAC的侵襲和轉(zhuǎn)移，可能是GAC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)，但具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的深入研究。

也有研究顯示了不同的結(jié)果。大腸癌中Paxillin表達(dá)水平顯著高于配對的正常黏膜，而和轉(zhuǎn)移癌之間則無明顯差異［16］。siRNA阻斷黏著斑激酶 (focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和Paxillin的信號途徑導(dǎo)致HeLa細(xì)胞運(yùn)動增強(qiáng)［17］。這些現(xiàn)象目前尚無肯定的解釋，可能與他們的實驗設(shè)計、組織存在差異、應(yīng)用的細(xì)胞遷移基質(zhì)不同等有關(guān)，也可能提示腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有比Paxillin更強(qiáng)的影響因素在起作用。Forest等［18］認(rèn)為，Paxillin的表達(dá)和磷酸化水平取決于腫瘤細(xì)胞的組織類型。在不同腫瘤中表達(dá)和磷酸化不同可能是因為Paxillin在細(xì)胞中的作用具有組織和器官特異性。

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