龔洪濤，郭一力，杜鳳和

原發(fā)性高血壓是一種多基因病，其發(fā)病機制較為復雜，與遺傳和環(huán)境等因素有關。腎素－血管緊張素系統(tǒng)是調節(jié)血壓的主要環(huán)節(jié)之一，其中血管緊張素原 (Angiotensinogen，AGT)是該系統(tǒng)的惟一初始底物，AGT基因與原發(fā)性高血壓的關系日益受到重視。有研究表明AGT基因啟動子區(qū)、第二外顯子以及啟動子區(qū)變異與高血壓之間存在關聯(lián)，本研究選擇AGT基因啟動子區(qū)A－6G和A－20C兩個位點，以原發(fā)性高血壓病患者作為研究對象，探討AGT基因A－6G和A－20C單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2005年6月—2007年1月于我院就診的漢族高血壓患者 (高血壓組)200例，男90例，女110例，年齡35～77歲，平均 (53.7±10.6)歲。均符合1999年世界衛(wèi)生組織/國際高血壓協(xié)會診斷標準，收縮壓≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)和 (或)舒張壓≥90 mm Hg。調查前2周內(nèi)服用降壓藥者及以往曾被診斷為高血壓者也被納入高血壓組，排除繼發(fā)性高血壓、嚴重心功能不全、嚴重肝腎功能障礙、3個月內(nèi)有心肌梗死、腦卒中者及妊娠或哺乳婦女。選擇我院同期就診的漢族正常血壓者 (對照者)192例，男98例，女94例，年齡 (51.6±8.1)歲。收縮壓＜140 mm Hg，且舒張壓＜90 mm Hg，均無服用降壓藥史、無高血壓家族史，對照組人群的排除標準與高血壓組的排除標準相同。

1.2 人體基本參數(shù)測定 測定身高、體質量、血壓等，血壓測量時靜坐10 min，使用標準臺式血壓計連續(xù)測量3次，每次間隔 10 min，取其均值。以體質量/身高2計算體質指數(shù)(body mass index，BMI)。

1.3 生物化學指標測定 抽取空腹靜脈血，離心取血清，采用生化分析儀檢測空腹血糖、三酰甘油 (triglyceride，TG)、總膽固醇 (total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL－C)及高密度脂蛋白膽固醇 (HDL－C)等指標。

1.4 DNA提取 取冷凍EDTA抗凝全血，水浴解凍，E.Z.N.ATM Blood DNA Kit(OMEGA)試劑盒提取 DNA，－20℃保存。

1.5 聚合酶鏈反應 (PCR) 擴增及限制性片斷長度多態(tài)性(PFLP)AGT－20A/C PCR引物:上游引物序列:F5'－TAGTACCCAGAACAACGGCAG－3'，下游引物序列:R5'－GTCGCTTCTGGCATCTGTC－3'，AGT－6A/G PCR引物:上游引物序列:F5'－ACATCTGAGAGAGACAAGACCG－3'，下游引物序列:R5'－CTCAGGCG CACACACCTAG－3'?？偡磻w系為10μl，包括20 ng基因組 DNA 2.0μl，PCR引物 (5 pmol/L)各0.6μl，2×Taq PCR Master Mix 5μl，用滅菌蒸餾水補充至10μl。PCR反應參數(shù):首先95℃變性10 min，隨后進行35個循環(huán)，每一循環(huán)包括94℃變性30 s，分別在62℃和59℃退火30 s，72℃延伸40 s。最后，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像儀成像。

分別取PCR擴增產(chǎn)物10μl，5 U Eco0109 I和BsiE I內(nèi)切酶 (美國promega公司生產(chǎn))，10 ENB緩沖液2μl，加雙蒸水補足體積為20μl，37℃溫育12 h后，取10μl上述產(chǎn)物，用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠在電壓100 V，1×TAE緩沖液中電泳45 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并保存酶切結果。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SSPS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用表示，計數(shù)資料用百分比表示。遺傳平衡檢驗采用哈代－溫伯格 (Hardy－Weinberg)平衡定律。兩組間臨床指標的比較采用u檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較 高血壓組與對照組的BMI和TC水平間差異有統(tǒng)計學意義 (p＜0.01，見表1)。

表1 高血壓組和對照組臨床資料比較Table 1 Comparison of clinic data between hypertension group and control group

2.2 AGT基因－20A/C和 －6A/G多態(tài)性 －20A/C位點PCR擴增產(chǎn)物為172 bp片段，若擴增片段中存在A－20C堿基替換，則產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶Eco0109 I位點 (RG/GNCCY)，AA基因型的擴增片段不存在Eco0109 I酶切位點，將出現(xiàn)一個172 bp片段;CC基因型存在Eco0109 I酶切位點，將出現(xiàn)126 bp和46 bp 2個片段;AC基因型則產(chǎn)生172 bp、126 bp和46 bp 3個片段。－6A/G位點PCR擴增產(chǎn)物為400 bp片段，若擴增片段中存在A－6G堿基替換，則產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶BsiE I位點 (CGRY/CG)，AA基因型的擴增片段不存在BsiE I酶切位點，將出現(xiàn)1個400 bp片段;GG基因型存在BsiE I酶切位點，將出現(xiàn)309 bp和91 bp兩個片段;AG基因型則產(chǎn)生400 bp、309 bp和91 bp 3個片段。

2.3 AGT基因－20A/C和－6A/G多態(tài)性與高血壓的關系AGT基因啟動子區(qū)－20A/C和－6A/G的基因型頻率在高血壓組和對照組的分布均符合Hardy－Weinberg平衡 (P＞0.05)。說明達到了遺傳平衡，具有群體代表性。兩組－20A/C等位基因和基因型頻率和－6A/G等位基因和基因型頻率的分布間差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表2、表3)。

表2 高血壓組和對照組AGT－20A/C基因型和等位基因頻率分布(例/頻率)Table 2 Frequency of AGT－20A/C genotype and allele in hypertensiongroup and control group

表3 高血壓組和正常對照組AGT－6A/G基因型和等位基因頻率分布(例/頻率)Table 3 Frequency of AGT－6A/G genotype and allele in hypertension group and control group

3 討論

人AGT基因位于染色體1q42～43，全長約12 kb，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，并且有兩個重要調節(jié)結構:第1外顯子上游區(qū)域的啟動子和3'端側面下游的增強子［1］。近年的研究表明，人類AGT基因核心啟動子區(qū)域位于TATA框與轉錄起始位點之間;AGT基因核心啟動子對AGT基因轉錄活性的調控，可能是AGT基因核心啟動子區(qū)域上游的一個順式作用元件hAG核心啟動子元件1與轉錄因子AGT核心啟動子結合因子1結合，通過與上游ALE序列和下游3'端增強子元件相互作用，影響基因的基礎轉錄速率［2］。而該區(qū)域 (－6)位點A/G和 (－20)位點A/C等變異多態(tài)性均可影響基因的轉錄活性［3－4］，有研究表AGT基因A－20C和A－6G單核苷酸多態(tài)性與非洲裔美國人和高加索人群的原發(fā)性高血壓有關［5］。Tiago等［3］研究了AGT基因啟動子區(qū)域變異與高血壓患者體質指數(shù)及動態(tài)血壓的相關性，表明AGT基因核心啟動子多態(tài)性顯著影響高血壓人群的體質指數(shù)和血壓。但是，Hilgers等［6］報道在德國男性的AGT多態(tài)性研究中，A－6G等位基因和基因型以及A－20C變異在高血壓病例組和對照組之間的分布無明顯差異，對血壓、腎臟血流量也無影響。另外一項關于A－6G多態(tài)性的大型研究涉及4個國家共4 322例研究對象，得出的結論是在任何一個人群中尚不能證明－6位點多態(tài)性與血壓相關，認為此位點對血壓調節(jié)的影響很?。?］。

本研究選擇漢族高血壓患者作為研究對象，發(fā)現(xiàn)AGT基因A－20C位點AA、AC、CC基因型頻率及A－6G位點AA、AG、GG基因型頻率在高血壓組分別為0.80、0.17、0.03和0.56、0.41、0.03，與對照組比較，兩組間差別無統(tǒng)計學意義，等位基因頻率亦無明顯差異。而國內(nèi)楊春等［8］對藏族人群進行研究，結果表明高血壓的發(fā)生與A－20C和A－6G多態(tài)性相關，在藏族高血壓人群中AGT基因－20A、－6G等位基因發(fā)生頻率較高，可能是藏族人群原發(fā)性高血壓的遺傳易感因子。李南方等［9］研究發(fā)現(xiàn)，基因A－6G變異雖然與哈薩克族人原發(fā)性高血壓相關，但是A－20C變異可能與該族人群原發(fā)性高血壓的發(fā)生無關?？紫闁|等［10］對AGT基因的研究表明，A－6G突變在高血壓和對照組間分布無明顯差異，與本研究結果相近，因此我們考慮AGT基因A－20C和A－6G位點在高血壓形成中起一定的作用，但在不同地區(qū)、不同種族及不同民族的人群中存在較大差異，并受其他一些因素的影響，同時由于本研究樣本量的因素，因此有關結論有待于在更大規(guī)模的人群中進一步驗證。AGT基因是高血壓遺傳易感性的主要候選基因之一［11］，因此進一步研究對于高血壓高危人群的風險預測，以及指導臨床預防、治療等具有重要的理論意義及臨床應用價值。

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4 Yanai K，Saito T，Hirota K，et al.Molecular variation of angiontensinogen core promoter element located between box and transcription in itiation site affects its transcriptty［J］.J Bio Chem，1997，272(48):30558－30568.

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9 李南方，周玲，吳衛(wèi)東，等.血管緊張素原基因5'端核心啟動子區(qū) (－6)A－G和 (－20)A－C變異與哈薩克族人原發(fā)性高血壓相關性分析［J］.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2004，21(1):23－28.

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