陳林暉 曹 俊 林 海 鄒曉平&

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1（210008） 南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科2

食管癌為常見惡性腫瘤之一，在最新發(fā)布的我國腫瘤發(fā)病和死亡資料中，其發(fā)病率和死亡率分居第六位（18.79/10 萬）和第四位（15.26/10 萬）[1]。 食管上皮內(nèi)瘤變（esophageal intraepithelial neoplasia,EIN）是食管正?；蚵匝装Y組織向鱗癌轉(zhuǎn)變過程中必經(jīng)的病理階段[2]。目前對EIN的發(fā)生、發(fā)展尚缺乏臨床實用的早期評估指標(biāo)，研究該階段食管上皮細胞基因表達的變化可能是尋找相關(guān)生物學(xué)標(biāo)記的重要手段。研究[3,4]發(fā)現(xiàn)部分食管鱗癌組織中腫瘤相關(guān)基因 RASSF1A（Ras-association domain family 1A）、MINT（methylated in tumor）31 啟動子區(qū)處于高甲基化狀態(tài)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）是在DNA復(fù)制期間維持DNA甲基化狀態(tài)最重要的酶，多種惡性腫瘤組織中存在不同程度的DNMT1高表達，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后不良相關(guān)[5,6]。本研究通過檢測正常食管組織、EIN和食管鱗癌組織中的RASSF1A、MINT31甲基化狀態(tài)和DNMT1蛋白表達，旨在探討RASSF1A、MINT31啟動子區(qū)高甲基化和DNMT1表達與EIN和食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

30例食管鱗癌石蠟包埋組織源自2008年1月～2009年12月南京市鼓樓醫(yī)院胸外科食管鱗癌切除術(shù)病例，其中男22例，女8例，年齡53～76歲，平均（62.83±6.41）歲，所有患者術(shù)前均未行放化療。40例高級別EIN和40例低級別EIN石蠟包埋組織源自同期南京市鼓樓醫(yī)院消化科內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)（EMR）或內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（ESD）病例，高級別組男 27例，女13例，年齡43～79歲，平均（60.30±7.58）歲，低級別組男29例，女11例，年齡48～79歲，平均（60.73±7.90）歲。行HE染色確定病變范圍后以顯微切割技術(shù)獲取EIN組織。20例正常食管石蠟包埋組織源自同期健康志愿者，其中男13例，女 7 例，年齡 45～77 歲，平均（60.70±8.68）歲。 所有標(biāo)本的診斷均經(jīng)病理學(xué)檢查證實，各組間性別構(gòu)成和年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。標(biāo)本獲取經(jīng)患者或志愿者知情同意。

二、主要試劑和儀器

組織DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Tissue DNA Kit,Omega Bio-Tek Inc.），亞硫酸氫鹽修飾試劑盒（EZ DNA Methylation-GoldTMKit,Zymo Research Corporation），PCR引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司合成），PCR試劑盒（TaKaRa TaqTMHot Start Version,TaKaRa Bio Inc.），CpG甲基轉(zhuǎn)移酶（CpG Methyltransferase M.SssⅠ,New England BioLabs Inc.），TA Cloning?試劑盒（TA Cloning?Kit Dual Promoter with pCR?Ⅱ vector,InvitrogenTMby Life Technologies）；即用型免疫組化超敏 UltraSensitiveTMSP試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），兔抗人 DNMT1單克隆抗體（Abcam plc.）。PCR 儀（2720 Thermal Cycler,Applied BiosystemsTMby Life Technologies），凝膠成像系統(tǒng)（GDS-8000 Image Acquisition and Analysis System,UVP,LLC），基因分析儀（3730xl DNA Analyzer,Applied BiosystemsTMby Life Technologies）。

三、方法

1.基因組DNA提取和修飾：取50～80 mg組織，以E.Z.N.A.Tissue DNA Kit提取基因組DNA，紫外分光光度法測定DNA濃度和純度。取1μg DNA以EZ DNA Methylation-GoldTMKit行亞硫酸氫鹽修飾，修飾后DNA－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR,MSP）：參考相關(guān)文獻[7,8]中的序列合成 RASSF1A、MINT31甲基化和非甲基化引物（見表1）。PCR反應(yīng)體系總體積 25μl，內(nèi)含修飾后的模板 DNA 2μl、上、下游引物各 0.5μl（10μmol/L）、TaKaRa TaqTMHS 0.125μl、dNTP Mixture 2.5μl、10 ×PCR Buffer（含 15 mmol/L MgCl2） 2.5μl和 ddH2O 16.875μl。反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30 s，相應(yīng)退火溫度（見表1） 45 s，72 ℃ 1 min，共 40 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。 以經(jīng)CpG Methyltransferase M.SssⅠ處理的人胎盤組織DNA作為甲基化陽性對照，以正常人外周血淋巴細胞DNA作為甲基化陰性對照，以去離子水代替模板DNA作為空白對照。取5μl MSP產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。如啟動子區(qū)CpG島完全甲基化，則只有甲基化引物能擴增出目的條帶；如完全未甲基化，則只有非甲基化引物能擴增出目的條帶；如為部分甲基化，則兩對引物均能擴增出目的條帶。部分甲基化歸為甲基化范疇。

表1 MSP引物序列、退火溫度和擴增片段長度

3.亞硫酸氫鹽修飾后測序（bisulfite sequencing PCR,BSP）：為驗證MSP檢測甲基化的準(zhǔn)確性，隨機選取部分MSP示RASSF1A甲基化陽性的EIN和食管鱗癌組織，以BSP方法行RASSF1A甲基化檢測。RASSF1A上游引物序列F 5’-GGG TTT TAT AGT TTT TGT ATT TAG GTT TTT-3’，下游引物序列 R 5’-CAA CTC AAT AAA CTC AAA CTC CCC C-3’[9]。PCR反應(yīng)體系同步驟2。反應(yīng)條件：94℃5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共 40 個循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后行割膠純化回收，克隆入pCR?Ⅱ載體。為判定RASSF1A的具體甲基化位點，每一樣本挑選至少10個克隆，以基因分析儀進行測序。

4.免疫組化染色：以免疫組化SP法檢測低級別EIN、高級別EIN和食管鱗癌組織中的DNMT1蛋白表達。石蠟包埋組織4μm厚連續(xù)切片，脫蠟，高壓熱修復(fù)，滴加1:2000稀釋的一抗和即用型二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。以已知DNMT1染色陽性的切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判斷：細胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為DNMT1染色陽性。于高倍鏡下（×200）隨機選取4個視野，計數(shù)陽性細胞并觀察染色強度。陽性細胞百分比計分：≤10%，0分；11%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；≥76%，4分。染色強度計分：無染色，0分；淡染色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。兩項計分乘積<3為陰性，≥3為陽性。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，組間RASSF1A、MINT31甲基化率和DNMT1蛋白表達陽性率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RASSF1A、MINT31甲基化情況

正常食管組織、低級別EIN、高級別EIN和食管鱗癌組織中RASSF1A甲基化率分別為5.0%、30.0%、35.0%和60.0%，鱗癌組織顯著高于EIN組織（χ2=6.875,P=0.009）和正常食管組織（χ2=15.407,P=0.000），EIN組織亦顯著高于正常食管組織（χ2=6.139,P=0.013），低級別與高級別EIN組織間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖1、表2）。

正常食管組織、低級別EIN、高級別EIN和食管鱗癌組織中MINT31甲基化率分別為5.0%、20.0%、32.5%和46.7%，鱗癌組織顯著高于EIN組織（χ2=4.192,P=0.041）和正常食管組織（χ2=9.921,P=0.002），EIN組織亦顯著高于正常食管組織（χ2=4.210,P=0.040），低級別與高級別EIN組織間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖1、表2）。

圖1 MSP檢測RASSF1A、MINT31甲基化電泳圖

表2 各組食管組織RASSF1A、MINT31甲基化率比較n(%)

二、BSP驗證MSP結(jié)果

隨機選取部分MSP示RASSF1A甲基化陽性的EIN和食管鱗癌組織，以BSP方法檢測一段包含14個CpG位點的RASSF1A啟動子序列，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)存在甲基化位點（見圖2）。

三、DNMT1蛋白表達

低級別EIN、高級別EIN和食管鱗癌組織中的DNMT1蛋白表達陽性率分別為32.5%（13/40）、55.0%（22/40）和 76.7%（23/30），各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見圖3）。

將病變食管組織按RASSF1A甲基化與否分組，甲基化組和非甲基化組DNMT1表達陽性率分別為 75.0%（33/44）和 37.9%（25/66），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.595,P=0.000），提示 RASSF1A甲基化與DNMT1高表達相關(guān)。

將病變食管組織按MINT31甲基化與否分組，甲基化組和非甲基化組DNMT1表達陽性率分別為65.7%（23/35）和 46.7%（35/75），組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.775,P=0.096），提示 MINT31 甲基化與DNMT1高表達無關(guān)。

圖2 BSP檢測RASSF1A甲基化及其甲基化位點

討 論

多種因素共同作用引起的癌基因激活和抑癌基因失活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。抑癌基因RASSF1A位于人類染色體3p21.3位點，具有促進細胞凋亡、維持微管穩(wěn)定、引起細胞周期阻滯等多種生物學(xué)功能，體內(nèi)、外實驗顯示其過表達對多種惡性腫瘤細胞具有生長抑制作用[10～12]。表觀遺傳學(xué)改變所致的RASSF1A失活是惡性腫瘤中最常見的分子水平改變之一，包括食管鱗癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織中存在啟動子區(qū)高甲基化所致的RASSF1A表達沉默[3,7,10]，并與腫瘤進展和預(yù)后不良相關(guān)[13,14]。MINT31基因位于人類染色體17q21位點，多種人類腫瘤中經(jīng)?？蓹z出MINT31雜合子缺失[15]，其啟動子區(qū)高甲基化與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)[16,17]。本研究采用MSP方法檢測了不同食管組織中兩種基因的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示正常食管組織中兩者甲基化率甚低，而在EIN和食管鱗癌組織中，兩者甲基化率依次顯著升高，高級別EIN組織的甲基化率與低級別EIN組織相比雖無明顯差異，但亦有增高趨勢，表明早在低級別EIN階段即已存在RASSF1A、MINT31啟動子區(qū)高甲基化，兩者在正常食管經(jīng)EIN進展至鱗癌的過程中起重要作用。本研究還以BSP方法驗證了MSP檢測甲基化的準(zhǔn)確性，結(jié)果證實MSP示RASSF1A甲基化陽性的EIN和食管鱗癌組織，RASSF1A啟動子區(qū)存在甲基化位點。

哺乳動物基因組DNA甲基化系由DNMTs家族所催化，其中DNMT1的主要作用為在每次DNA復(fù)制后的修飾過程中對新合成的DNA鏈進行甲基化，對DNA甲基化的維持具有重要意義[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)不同級別胰腺上皮內(nèi)瘤變（PanIN）之間、PanIN與胰腺導(dǎo)管腺癌之間、高中分化與低分化胰腺導(dǎo)管腺癌之間的DNMT1蛋白表達陽性率均有顯著差異，提示DNMT1表達增高參與了胰腺從癌前病變至侵襲性癌的多階段癌變過程。對宮頸鱗癌的研究[20]則顯示，從正常鱗狀上皮至低級別、高級別上皮內(nèi)瘤變，DNMT1蛋白表達逐漸增高，進展至微浸潤癌后，其表達則隨腫瘤浸潤而逐漸降低，提示DNMT1表達增高僅與宮頸多階段癌變過程的早期階段有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，從低級別、高級別EIN至食管鱗癌，DNMT1表達陽性率依次顯著升高，表明DNMT1高表達在低級別EIN階段即開始發(fā)揮作用，促進抑癌基因等的甲基化，至食管鱗癌階段，其活性進一步增強。

本研究中存在RASSF1A甲基化的EIN和食管鱗癌組織，DNMT1表達陽性率顯著高于RASSF1A非甲基化組織，表明RASSF1A甲基化與DNMT1高表達相關(guān)。甲基化修飾導(dǎo)致抑癌基因表達沉默，參與了EIN和食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究EIN和食管鱗癌組織中的MINT31甲基化與DNMT1高表達無關(guān)，提示MINT31甲基化的發(fā)生可能還有其他機制參與。

圖3 各組病變食管組織DNMT1蛋白表達（免疫組化SP法，×200）

由于本研究所檢測的組織均為石蠟包埋組織而非新鮮組織，故未能對RASSF1A、MINT31的表達行蛋白質(zhì)印跡法或定量PCR分析；由于未找到可供參考的PCR引物序列和反應(yīng)條件，自行設(shè)計引物的檢測結(jié)果又不甚理想，故亦未能對MINT31甲基化行BSP驗證。上述不足之處將在后續(xù)研究中設(shè)法完善。

綜上所述，RASSF1A、MINT31啟動子區(qū)高甲基化和DNMT1表達上調(diào)在EIN和食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其檢測或許有助于EIN的評估，并為食管鱗癌的診斷提供參考。

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