肖衛(wèi)華 陳佩杰

1 上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院（上海 200438）

2 湘南學(xué)院體育系

巨噬細(xì)胞是重要的非特異性免疫細(xì)胞，具有趨化、吞噬、殺菌、分泌炎性因子和抗原遞呈等多種功能，廣泛分布于肝臟、腎臟、肌肉、肺、腹腔和血液等多個(gè)組織器官，在機(jī)體病菌防御、炎癥反應(yīng)、壞死組織清除和抑制腫瘤等方面具有重要作用[1]。胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）可介導(dǎo)生長(zhǎng)激素的功能，具有促進(jìn)蛋白合成、促進(jìn)細(xì)胞增殖等多種功能[2]。研究表明，巨噬細(xì)胞可表達(dá)IGF-1[3]，且巨噬細(xì)胞來(lái)源的IGF-1在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)展[3，4]、機(jī)體炎癥反應(yīng)[5]、肺纖維化[6]、防止肌肉萎縮及促進(jìn)損傷肌肉的修復(fù)[7]等過(guò)程中均有重要作用。

IGF-1前體可選擇性剪接產(chǎn)生多種異構(gòu)體，如IGF-1Ea、IGF-1Eb等[8]，IGF-1Ea即為可由機(jī)體多個(gè)組織器官產(chǎn)生、已被廣泛研究的IGF-1。嚙齒目動(dòng)物的IGF-1Eb相比IGF-1Ea插入了52個(gè)堿基對(duì)的一段序列，導(dǎo)致其羧基端有別于IGF-1Ea，功能和信號(hào)途徑均不同于 IGF-1Ea[9]，IGF-1Eb 被認(rèn)為只能在機(jī)械應(yīng)力敏感組織如肌肉中才可檢測(cè)到，所以又被稱為機(jī)械生長(zhǎng)因子（mechano growth factor，MGF）[8]。MGF 具有不同于 IGF-1 的多種功能，具有激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，防止肌肉萎縮，促進(jìn)肌肉體積增大和力量增加等多種功能[10，11]。MGF已是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一[12-14]。現(xiàn)有研究多集中于肌肉，對(duì)其他組織或細(xì)胞MGF的探討較少。巨噬細(xì)胞能表達(dá)IGF-1，但其能否表達(dá)MGF國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。運(yùn)動(dòng)特別是過(guò)度訓(xùn)練作為一種強(qiáng)烈應(yīng)激，是否對(duì)巨噬細(xì)胞IGF-1和MGF表達(dá)產(chǎn)生影響，過(guò)度訓(xùn)練時(shí)補(bǔ)充巨噬細(xì)胞必需的能量物質(zhì)谷氨酰胺是否影響其IGF-1和MGF表達(dá)，均無(wú)相關(guān)資料。故本研究通過(guò)觀察過(guò)度訓(xùn)練及補(bǔ)充谷氨酰胺對(duì)大鼠巨噬細(xì)胞IGF-1、MGF基因表達(dá)的影響，為IGF-1和MGF研究開(kāi)拓新視野。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

8周齡健康雄性Wistar大鼠40只，體重180± 10 g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK（滬）2007-0005]。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22 ± 2℃，相對(duì)濕度50%～70%，每日光照時(shí)間12 h，自由飲食。將大鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（C）、過(guò)度訓(xùn)練組（E）、過(guò)度訓(xùn)練補(bǔ)充谷氨酰胺組（EG）。后兩組根據(jù)取材時(shí)間不同再分為2組：運(yùn)動(dòng)后36 h取材組（E1、EG1）和運(yùn)動(dòng)后7天取材組（E2、EG2）。總計(jì)5組，每組8只。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案及谷氨酰胺補(bǔ)充方案

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，E組、EG組開(kāi)始進(jìn)行遞增負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6次，周日休息，共11周。運(yùn)動(dòng)方案參照文獻(xiàn)的方法[15]（表1）。EG組L-谷氨酰胺（Sigma，產(chǎn)品編號(hào)G-3126）補(bǔ)充方案參考金其貫[16]方法并稍作修改，前4周逐周增加運(yùn)動(dòng)量至目標(biāo)運(yùn)動(dòng)量，期間不補(bǔ)充谷氨酰胺，第5至8周灌胃（0.8 g/kg/d），以后幾周加至飲用水補(bǔ)充，劑量逐周加大到1.1 g/kg/d。

表1 運(yùn)動(dòng)方案

1.3 腹膜巨噬細(xì)胞分離與純化

最后1次訓(xùn)練后36 h或7天后，斷頭處死大鼠，腹腔注射12 ml RPMI1640培養(yǎng)液（GIBCO公司），腹部按摩2分鐘后靜置5分鐘，在腹部作一長(zhǎng)約2 cm切口并小心吸取腹腔灌洗液入離心管。離心去上清，0.1 M PBS洗兩遍后用含10%胎牛血清（GIBCO公司）的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并移入6孔板，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2 h，傾去不貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞[17]，PBS輕柔洗滌2次，加入PBS小心吹打細(xì)胞入離心管，離心去上清收集細(xì)胞。

1.4 RNA抽提與cDNA合成

使用異硫氫酸胍－氯仿經(jīng)典法抽提總RNA，主要試劑Trizol購(gòu)自invitrogen公司。按Fermentas公司第一鏈cDNA合成試劑盒（K1621）說(shuō)明，在0.2 ml eppendorf管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：65℃，5 min；4℃，2 min；25℃，5 min；42℃，60 min；70℃，5 min。反應(yīng)總體積20 μl，合成的cDNA儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR

設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參基因熒光定量引物（表2），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。使用Rotor-Gene 3000定量PCR儀（Corbett Reseach）進(jìn)行雙標(biāo)曲法相對(duì)定量PCR（SYBR Green試劑盒購(gòu)自Fermentas公司）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建：取PCR產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)（105units），依次10倍梯度稀釋，共6個(gè)濃度。MGF基因在1～105units范圍內(nèi)，檢測(cè)閾值（CT）與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，兩者相關(guān)系數(shù)r >0.99（圖1）。樣品中目的基因和內(nèi)參基因CT值可通過(guò)各自標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度，二者比值即為該目的基因相對(duì)表達(dá)量，最后結(jié)果以處理組某基因表達(dá)量相對(duì)對(duì)照組變化倍數(shù)表示。此外，熔解曲線分析顯示MGF呈單一產(chǎn)物峰。IGF-1資料相同。

表2 熒光定量PCR引物

圖1 MGF標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)水平定為0.05。

2 結(jié)果

表3顯示，安靜狀態(tài)下巨噬細(xì)胞即可表達(dá)IGF-1和MGF。11周過(guò)度訓(xùn)練后36 h，巨噬細(xì)胞IGF-1、MGF表達(dá)量顯著增加，分別約為安靜對(duì)照組的21倍和92倍（P < 0.01）。EG1組IGF-1、MGF表達(dá)顯著增加，分別約為安靜對(duì)照的10倍和37倍（P < 0.01），但顯著低于E1組（P < 0.01）。停訓(xùn)后恢復(fù)7天，E2組、EG2組IGF-1、MGF表達(dá)量分別與E1組、EG1組相比均顯著降低（P <0.01），但與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

表3 各組IGF-1、MGF基因表達(dá)（相對(duì)C組變化倍數(shù)）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，安靜狀態(tài)下巨噬細(xì)胞內(nèi)IGF-1和MGF均有表達(dá)。11周過(guò)度訓(xùn)練后，巨噬細(xì)胞IGF-1和MGF mRNA表達(dá)顯著增加，與安靜組相比分別增加了約21倍和92倍。巨噬細(xì)胞MGF表達(dá)相比IGF-1對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激更敏感，這與肌肉MGF表達(dá)水平對(duì)訓(xùn)練更敏感的報(bào)道一致[18]。運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期，IGF-1和MGF表達(dá)仍處于較高水平，但與安靜對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。因IGF-1和MGF有多種功能，因此，過(guò)度訓(xùn)練狀態(tài)下巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量IGF-1和MGF可能參與機(jī)體多種生理過(guò)程。但巨噬細(xì)胞IGF-1和MGF過(guò)度活化對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生何影響，相關(guān)資料較少。有報(bào)道顯示，IGF-1有促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α[19]和IL-1β[20]等炎性因子，促進(jìn)巨噬細(xì)胞攝取和降解低密度脂蛋白[21]，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向炎癥部位遷移參與炎癥反應(yīng)[3]，調(diào)控巨噬細(xì)胞的分化和存活[22]等多種功能。而國(guó)內(nèi)外尚無(wú)MGF是否對(duì)巨噬細(xì)胞功能產(chǎn)生影響的研究。本課題組通過(guò)離體實(shí)驗(yàn)（另文發(fā)表）發(fā)現(xiàn)，不同濃度的重組IGF-1對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能、活性氧生成無(wú)明顯影響；而MGF呈濃度依賴性地抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能，較低濃度MGF對(duì)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)活性氧（ROS）生成產(chǎn)生明顯的抑制作用。吞噬功能是巨噬細(xì)胞抵御病原入侵最重要的功能之一，生理濃度的ROS是巨噬細(xì)胞發(fā)揮其正常功能的基礎(chǔ)[23-25]，因此，MGF對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬和ROS產(chǎn)生明顯抑制效應(yīng)表明，MGF是巨噬細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控因子。本研究中，過(guò)度訓(xùn)練使巨噬細(xì)胞通過(guò)自分泌形式產(chǎn)生大量MGF，抑制巨噬細(xì)胞功能，這可能是過(guò)度訓(xùn)練造成免疫抑制的機(jī)制之一。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充谷氨酰胺可部分抑制巨噬細(xì)胞IGF-1和MGF對(duì)過(guò)度訓(xùn)練的應(yīng)答，顯著降低過(guò)度訓(xùn)練后巨噬細(xì)胞IGF-1和MGF增加幅度。這對(duì)巨噬細(xì)胞可能具有重要意義：即減輕MGF過(guò)度激活對(duì)巨噬細(xì)胞功能的不利影響，利于巨噬細(xì)胞維持正常功能?？傊狙芯拷Y(jié)果首次證明了巨噬細(xì)胞可表達(dá)MGF，且在過(guò)度訓(xùn)練時(shí)急劇增加，這將為MGF研究開(kāi)啟一個(gè)全新的視角：即巨噬細(xì)胞來(lái)源的MGF可能在機(jī)體多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。

4 總結(jié)

靜息態(tài)巨噬細(xì)胞可表達(dá)IGF-1和MGF。過(guò)度訓(xùn)練可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞IGF-1和MGF表達(dá)，且MGF表達(dá)對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激更敏感。補(bǔ)充谷氨酰胺可部分抑制巨噬細(xì)胞IGF-1和MGF對(duì)過(guò)度訓(xùn)練的應(yīng)答。

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