李海鵬 楊東升 王立豐 關(guān)尚一 丁樹哲 盧健

1 上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院（上海 200438）

2 華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院

3 浙江工業(yè)大學(xué)體質(zhì)健康研究中心

Sarcopenia（肌肉衰減征，又稱肌力流失）是一種以骨骼肌質(zhì)量減少、肌肉力量及耐力顯著下降為主要特征的衰老性機(jī)能減退，嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量[1，2]。有研究表明，Sarcopenia的發(fā)生涉及細(xì)胞凋亡、蛋白合成減少、激素分泌不足、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元失能等多種因素，其中細(xì)胞凋亡機(jī)制逐漸成為歸因研究的焦點(diǎn)，而細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心——線粒體則通過Caspase依賴與非依賴性兩條途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3，4]。

Kim等曾提出耐力運(yùn)動(dòng)能延緩Sarcopenia發(fā)生[5]。運(yùn)動(dòng)作為特殊應(yīng)激手段，對(duì)Sarcopenia的發(fā)生所產(chǎn)生影響的機(jī)制有待闡明。目前，運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌細(xì)胞凋亡的影響已有不少研究，而運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老骨骼肌細(xì)胞凋亡以及凋亡信號(hào)途徑中相關(guān)凋亡基因的影響卻罕見實(shí)證報(bào)道[6]。大多數(shù)研究者僅以綜述形式進(jìn)行了報(bào)道，而即使有實(shí)證研究，也多局限于檢測(cè)衰老骨骼肌凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因（Bcl-2和Bax）的變化，忽略了凋亡途徑中各凋亡基因可能存在的各向異性的真實(shí)事件，不能真正闡釋不同途徑中凋亡基因在運(yùn)動(dòng)干預(yù)后的變化。本實(shí)驗(yàn)以快速老化小鼠（SAMP8）為研究對(duì)象，初步探究跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌Caspase依賴與非依賴性細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑中各凋亡基因mRNA水平的影響，為運(yùn)動(dòng)預(yù)防Sarcopenia的理論提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性快速老化（SAMP8系）小鼠30只，購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證編號(hào)：W-J津?qū)崉?dòng)質(zhì)M準(zhǔn)字第006號(hào)）。購入后于華東師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房IVC獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)系統(tǒng)中在SPF（Specific pathogenfree）條件下分籠飼養(yǎng)，以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料喂養(yǎng)，飼料購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[許可證號(hào)：SCXK（滬）2007?0005]。自由飲食、飲水。自然光照并遵循明暗周期，溫度范圍20 ± 2℃，相對(duì)濕度55±5%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組等情況見表1。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)和訓(xùn)練情況

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后OE組（30周齡時(shí)）開始，采用動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行耐力訓(xùn)練。訓(xùn)練時(shí)間選擇在暗周期（18:00～20:00），每天1次，每周5天。參照Bedford與Siu的方案[7，8]，隨動(dòng)物運(yùn)動(dòng)具體情況適時(shí)調(diào)整。第1周速度為15 m/min，時(shí)間15 min；第2周為20 m/min×25 min；第3周為25 m/min×25 min；第4周為25 m/min×30 min；第5～8周均為30 m/min×30 min。

1.3 取材及計(jì)算SI

末次跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后24～48 h，小鼠斷頭處死，迅速取完整后肢腓腸肌，稱量肌肉重量，錫箔紙包裹并標(biāo)記后迅速置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。選用Edstrom提出的靶骨骼肌的質(zhì)量（mg）/受試體重（g）求得 Sarcopenia Index（SI）值，并以此作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[9]，并參照Baumgartner等的方法[10]（老年組SI值與青年組相比顯著降低，且差異大于2倍SD）進(jìn)行判定。

1.4 RNA提取及鑒定

取腓腸肌樣品100 mg左右，參照Trizol試劑盒（購自Invitrogen 公司）說明書抽提RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法（OD260/OD280）對(duì)RNA的完整性和純度進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)28s、18s、5s三條帶以及OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間。

1.5 RNA逆轉(zhuǎn)錄

取 RNA 2 μl以 Oligo（dT）15（50 pmol/μl）為隨機(jī)引物合成cDNA。M-MLV試劑盒購自Promega公司。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

查找目的基因全序列，采用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，相關(guān)信息見表2。

Realtime PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中SYBR Premix（TOYOBO公司）10 μl，前向引物和反向引物（10 μM）各 1 μl，模板 4 μl，其余用無 RNase水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為Stage 1：（1×）95℃，3 min；Stage 2：（45×）Step 1：95 ℃，20 s，Step 2：Tm，20 s，Step 3：72 ℃，20 s（收集熒光）；Stage 3：（1×）95℃，1 min；Tm，20 s；緩慢升溫（收集熒光）至95℃，10 s。經(jīng)儀器自動(dòng)分析，各基因融解曲線（Melt Curve）均為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高。以β-actin為內(nèi)參基因，各目的基因相對(duì)量（Relative Expression，RE）按 2－ΔΔCt計(jì)算求得。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS for windows15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以表示，利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異，顯著性水平為P < 0.05。

2 結(jié)果

2.1 SI值

OC組SI值（3.84±0.39 mg/g）較YC組SI值（4.54±0.24 mg/g）顯著下降（P < 0.05），且下降幅度大于2倍SD；OE組SI值（3.90 ± 0.62 mg/g）較OC組無顯著性差異（P > 0.05）。

2.2 骨骼肌Caspase依賴性凋亡通路中凋亡基因表達(dá)

表3顯示，與YC組相比，OC組apaf-1和Caspase-3 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05），Cyt C和Caspase-9 mRNA表達(dá)未見明顯變化（P > 0.05）。與OC組相比，OE組CytC mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P< 0.05），Caspase-3 mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P < 0.05），apaf-1和Caspase-9 mRNA表達(dá)未見明顯變化（P >0.05）。

表3 各組Caspase依賴性凋亡基因mRNA表達(dá)

2.3 骨骼肌Caspase非依賴性凋亡通路中凋亡基因表達(dá)

表4顯 示， 與YC組 相 比，OC組PARP mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05），AIF mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P < 0.05），Endo G mRNA表達(dá)無明顯變化（P > 0.05）。與OC組相比，OE組PARP mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P < 0.05），AIF mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P < 0.05），Endo G mRNA表達(dá)無明顯變化（P > 0.05）。

表4 各組Caspase非依賴性凋亡基因mRNA的表達(dá)

3 討論

SAMP8小鼠是一類正常發(fā)育和成熟后顯示衰老加速效應(yīng)的近交系小鼠，一般壽命約為358天（約51周齡），其在生長(zhǎng)期（16～24周齡）與普通純種小鼠無異，但在度過生長(zhǎng)期后迅速出現(xiàn)老化特征。故本實(shí)驗(yàn)OC組及OE組SAMP8小鼠（38周齡）均已步入老年階段。OC組小鼠腓腸肌SI值較YC組小鼠顯著降低，且降幅達(dá)2倍SD以上，提示SAMP8小鼠已表現(xiàn)出Sarcopenia癥狀，這與Derave的研究結(jié)果一致[11]；然而，與OC組相比，OE組SI值未見明顯變化，提示跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)未能有效增加Sarcopenia小鼠SI值。

本研究結(jié)果顯示，與YC組相比，OC組小鼠腓腸肌apaf-1、Caspase-3和PARP mRNA均顯著上調(diào)，AIF mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，而Cyt C、Caspase-9和Endo G mRNA表達(dá)未見顯著變化。這提示雖然Caspase-3、AIF和Endo G均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但較之Caspase非依賴性凋亡途徑，在Sarcopenia發(fā)生發(fā)展過程中，Caspase-3誘導(dǎo)的Caspase依賴性細(xì)胞凋亡途徑可能隨衰老進(jìn)程逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，而AIF（apoptosis inducing factor，凋亡誘導(dǎo)因子）和Endo G （Endonuclease G，核酸內(nèi)切酶G ）誘導(dǎo)的Caspase非依賴性細(xì)胞凋亡途徑則可能表現(xiàn)為凋亡潛能隨衰老進(jìn)程呈現(xiàn)各向異性。值得注意的是，Baker等研究發(fā)現(xiàn)，隨衰老進(jìn)程，F(xiàn)344×BN （Fischer344 × Brown Norway）大鼠跖肌Caspase-3和AIF mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)，且Caspase-3和AIF表達(dá)均與Sarcopenia的發(fā)生進(jìn)程高度相關(guān)[12]。此外，Marzetti等觀察到老年F344×BN大鼠腓腸肌AIF和Endo G表達(dá)顯著上調(diào)，而Cyt C未見隨衰老進(jìn)程出現(xiàn)顯著變化，由此該研究者認(rèn)為，線粒體介導(dǎo)的Caspase非依賴性細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑較Caspase依賴性細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑在Sarcopenia的發(fā)生進(jìn)程中發(fā)揮更重要的作用[13]。但以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果大相徑庭，其原因可能是Sarcopenia在骨骼肌衰老進(jìn)程中對(duì)凋亡途徑的選擇可能有一定的物種差異性。鑒于目前國(guó)內(nèi)尚無F344×BN大鼠種源的提供，因而只能選取較理想的SAMP8小鼠進(jìn)行研究，這也提示Sarcopenia發(fā)生機(jī)制的凋亡歸因不能一概而論。Pistilli研究認(rèn)為，雖然促凋亡環(huán)境可能導(dǎo)致衰老性骨骼肌萎縮，但具體凋亡途徑可能因衰老程度以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等因素不同而存在差異[14]。這為本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了有效的解釋依據(jù)。

本研究中，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著上調(diào)了腓腸肌Cyt C和AIF mRNA表達(dá)，顯著下調(diào)了Caspase-3和PARP mRNA表達(dá)，而apaf-1、Caspase-9和Endo G mRNA未見明顯變化，提示正常情況下，Cyt C和AIF均被限制在線粒體間隙內(nèi)，當(dāng)受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，Cyt C和AIF分子可從線粒體釋放到細(xì)胞漿中，其中Cyt C通過與apaf-1、Procaspase-9以及ATP等形成凋亡小體誘導(dǎo)Caspase依賴性凋亡，而AIF可再通過核定位信號(hào)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，在細(xì)胞核中結(jié)合DNA并激活染色體凝聚，引起DNA呈大片段斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而在運(yùn)動(dòng)干預(yù)下，由于磷酸原供能系統(tǒng)主要參與運(yùn)動(dòng)供能，可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP穩(wěn)態(tài)失衡，雖然Cyt C有所上調(diào)，但不能形成功能完整的凋亡小體復(fù)合物，從而無法誘導(dǎo)激活凋亡效應(yīng)子——Caspase-3表達(dá)。本研究中Caspase-3下調(diào)則可能由獨(dú)立于線粒體之外的其他途徑完成，并在一定程度上對(duì)衰老骨骼肌萎縮起保護(hù)作用[15]。Song等的研究結(jié)果顯示，12周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)顯著下調(diào)老年大鼠腓腸肌Caspase-3表達(dá)，并弱化促凋亡信號(hào)，進(jìn)而緩解衰老骨骼肌萎縮[16]。而本研究中，雖然運(yùn)動(dòng)對(duì)Caspase依賴性凋亡途徑有所抑制，進(jìn)而保護(hù)衰老骨骼肌進(jìn)一步萎縮，但AIF誘導(dǎo)的Caspase非依賴性細(xì)胞凋亡途徑卻在運(yùn)動(dòng)過程中逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，進(jìn)一步誘導(dǎo)衰老骨骼肌通過該途徑進(jìn)入細(xì)胞凋亡程序，而Caspase非依賴性的另一凋亡誘導(dǎo)因子——Endo G依舊表現(xiàn)為凋亡沉默。由此可見，細(xì)胞凋亡可由不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)，即信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑?jīng)Q定細(xì)胞命運(yùn)[17]。一方面，不同信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在不同細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用不同，或啟動(dòng)或阻礙細(xì)胞凋亡；另一方面，同一信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在不同組織/細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞凋亡的影響存在強(qiáng)弱差異，甚至相反的作用。

4 總結(jié)

與Caspase非依賴性凋亡途徑相比，Caspase依賴性凋亡途徑在Sarcopenia的發(fā)生中發(fā)揮更重要的作用；跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)在一定程度上能弱化衰老骨骼肌Caspase依賴性凋亡通路的促凋亡基因mRNA表達(dá)，但對(duì)AIF誘導(dǎo)的Caspase非依賴性凋亡基因mRNA的表達(dá)卻呈現(xiàn)上調(diào)作用。

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