劉肖萍，張志遠，劉玉松，趙 琳，范 旭，徐紅運，張鳳華，夏平安，崔保安

(河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002)

Fc受體(FcR)是特異親和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的細胞表面分子，廣泛表達于效應細胞和免疫輔助細胞表面［1］，屬于 Ig基因超家族成員.Fc受體通過與Ig Fc區(qū)域結合，參與Ig介導的生理功能或病理損傷過程，它不僅賦于免疫細胞殺傷病毒與細菌、清除免疫復合物、溶解癌變細胞的能力，而且參與免疫反應的啟動與調節(jié)，在免疫防御中發(fā)揮非常重要的作用［2］.

人的 FcγR 有 FcγRI，FcγRII，FcγRIII共3 個亞群，小鼠的 FcγR 有 FcγRI，FcγRII，FcγRIII，FcγRIV共4個亞群，每一個亞群都存在幾種亞類和不同的RNA剪接異構體.FcγR在功能上可以分為活化性受體和抑制性受體.前者大都通過偶聯含有免疫受體酪氨酸激活基序ITAM的γ二聚體傳遞活化信號;后者則主要通過自身分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸抑制基序ITIM傳導抑制信號.FcγRIIB作為目前唯一發(fā)現的抑制性FcγR，在天然免疫和適應性免疫反應的負性調節(jié)方面發(fā)揮重要作用［3］.從豬體內分離到的 Fc 受體有 FcγRI，FcγRII，FcγRIII 3 個亞群［4～6］.豬的 FcγRIIB(swFcγRIIB)氨基酸序列與人、鼠的相比較，有高度的同源性，胞內區(qū)都含有1個保守的ITIM抑制基序.推斷豬FcγRIIB可能有相似的抑制功能［5］.QIAO 等［5］克隆并鑒定了swFcγRIIB受體，其胞外區(qū)含有 2個 Ig結構域(EC1，EC2).劉玉松等［7，8］隨后發(fā)現其存在 RNA剪接異構體 swFcγRIIB1(GenBank accession No.FJ608551)，與 swFcγRIIB受體相比，胞內區(qū)有57個堿基的插入，為了進一步研究swFcγRIIB1各結構域的生物學功能及其免疫調節(jié)機制，本研究表達了 swFcγRIIB1 胞外區(qū) swFcγRIIB1-EY，EC1 結構域swFcγRIIB1-AY 和 EC2結構域 swFcγRIIB1-BY 融合蛋白.并對表達蛋白進行純化，用3種純化蛋白分別免疫小鼠，制備抗3種融合蛋白多克隆抗體，經Western blot檢測證實制備的多抗可以與各自的融合蛋白特異性結合，表明制備的多抗具有高度特異性.從而為進一步研究swFcγRIIB RNA剪接異構體swFcγRIIB1結構、功能和免疫特性奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 質粒與菌株

豬 FcγRIIB1 克隆載體 pTG19-T-swFcγRIIB1，原核表達載體pET-32a，宿主菌 DH5α，BL21均由河南農業(yè)大學獸醫(yī)微生物與免疫學研究室保存.

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、rTaq酶、限制性內切酶 KpnⅠ，EcoRⅠ購自大連寶生物公司，IPTG，DAB顯色試劑盒，尿素購自上海生工生物工程技術服務有限公司，HRP標記的羊抗鼠IgG為北京博奧森生物技術公司產品，DNA膠回收純化試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，酶標板購自華美生物工程公司.硝酸纖維素膜(NC膜)購自大連寶生物工程有限公司.

1.3 引物設計

通過分析swFcγRIIB1基因序列，應用Premier軟件，分別設計3對引物并在引物兩端加入KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位點.上述引物由上海博瑞生物公司合成.

表1 擴增swFcγRⅡB1胞外區(qū)及結構域引物序列Table 1 The sequences of swFcγRⅡB1 and primers used in amplifying extracellular domain and structural domains

1.4 重組原核表達載體的構建

以pTG19-T-swFcγRIIB1為模板，設計3對引物擴增目的片段.反應條件為:95℃預變性5 min，PCR循環(huán)為95℃ 45 s，退火溫度55.8℃ 45 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)后，72℃延伸10 min.PCR產物經切膠回收，用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接至pET-32a載體中，按常規(guī)方法［9］轉化大腸桿菌DH5α，并涂布于瓊脂平板培養(yǎng)，挑取陽性菌落，進行PCR鑒定，酶切鑒定及序列測定，篩選陽性重組表達質粒 pET-EY，pET-AY，pET-BY.

1.6 融合蛋白在大腸桿菌中的表達

將重組質粒pET-EY，pET-AY，pET-BY轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，在轉化平皿中挑取單個菌落，37℃振蕩培養(yǎng)16 h，將培養(yǎng)物以1∶100的稀釋度接種于含終質量濃度為100 mg·L－1氨芐青霉素新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到為0.5～1.0時，分別加入不同終濃度的IPTG(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 nmol·L－1)和進行不同時間(2，3，4，5，6，7 h)的誘導表達，同時設立重組質粒和空載體未誘導，空載體誘導和BL21對照.然后收取表達產物通過12%的SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白的表達量，以確定 swFcγRIIB1-EY，swFcγRIIB1-AY，swFcγRIIB1-BY 融合蛋白的最佳誘導表達條件.

1.7 涵體的制備、洗滌與純化

按最佳誘導表達條件誘導表達基因工程重組菌500 mL，離心收集菌體，按每克濕菌沉淀加入約3 mL 50 mmol·L－1PBS(pH 值為 8.0)懸浮菌體，反復凍融10次，加入終質量濃度為100 mg·L－1溶菌酶，混勻后冰浴10 min，然后4℃作用30 min.隨后在冰浴中進行超聲波處理，每次超聲處理4 s，間隔10 s，共作用80～100次，加入終質量濃度為10 mg·L－1DNase，作用至菌液不再粘稠.按參考文獻［10］提供方法進行包涵體的洗滌與純化.

1.8 包涵體的復性

將溶解的上清裝入已處理的透析袋內，置于復性緩沖液中在4℃下進行梯度透析，復性緩沖液中尿素濃度依次遞減 4，3，2，1，0.5，0 mol·L－1，換液間隔時間為10～12 h.之后將其置于雙蒸水中4℃攪拌過夜.

1.9 抗融合蛋白多克隆抗體的制備

選取6周齡雄性小白鼠60只，隨機分為3組，每組20只(試驗組10只和對照組10只).試驗組分別以3種純化的融合蛋白為抗原，按體積比1∶1混合弗氏完全佐劑皮下注射進行初次免疫，抗原量為120 μg·只－1.初免后免疫佐劑改為弗氏不完全佐劑，每2周免疫1次，共免疫2次，對照組免疫佐劑不加融合蛋白，免疫程序同試驗組.

1.10 ELISA檢測小鼠血清抗體效價

采用方陣滴定法確定3種融合蛋白抗原的包被濃度以及陰、陽性血清的最佳工作濃度，通過優(yōu)化包被時間、封閉液及其作用時間，酶標二抗稀釋度及作用時間，根據結果確定最佳反應條件［11］，ELISA檢測小鼠血清抗體.

1.11 融合蛋白的免疫活性檢測

按常規(guī)方法進行Western blot分析［12］，應用所制的鼠源抗3種融合蛋白的抗體和HRP標記的羊抗鼠IgG檢測融合蛋白的免疫學活性.同時設空白載體誘導產物，BL21對照.

2 結果與分析

2.1 目的片段擴增

分別利用3對引物通過 PCR方法從載體pTG19-T-swFcγRIIB1分別擴增胞外區(qū)，EC1結構域和EC2結構域，擴增的片段大小分別為432，183，162 bp，結果分別見圖1～圖3.

2.2 重組表達質粒的鑒定

分別將編碼swFcγRⅡB1胞外區(qū)及EC1結構域、EC2結構域的DNA亞克隆到pET32a表達載體的T7啟動子下游，提取重組表達質粒pET-EY，pET-AY，pET-BY用PCR鑒定，擴出了預期條帶.用KpnⅠ，EcoRⅠ酶切鑒定，分別得到了與預期結果相附的2個片段(圖4～圖6).測序分析表明，成功構建了pET-EY，pET-AY，pET-BY 3種質粒.

2.3 融合蛋白的表達及純化

swFcγRIIB1-EY，swFcγRIIB1-BY，swFcγRIIB1-AY融合蛋白分別含有144，61，54個氨基酸，分子量約為36，29，27 kD.表達產物均以包涵體形式存在，經12%SDS-PAGE，與預計大小一致.誘導6 h表達量最高，swFcγRIIB1-EY，swFcγRIIB1-BY 融合蛋白以終濃度為1.0 mmol·L－1的IPTG誘導表達效果最佳，swFcγRIIB1-AY 融合蛋白為 0.8 mmol·L－1.融合蛋白經提取與純化后所占菌體蛋白百分比可提升到85%.結果見圖7～圖9.

圖7 重組質粒pET-EY在大腸桿菌中的表達Fig.7 Expression of the recombinant plasmid pET-EY

圖8 重組質粒pET-AY在大腸桿菌中的表達Fig.8 Expression of the recombinant plasmid pET-AY

2.4 抗融合蛋白鼠源抗體效價

ELISA方法檢測獲得的3種鼠源血清，結果顯示其血清中含有較高活性的特異性抗體.3種融合蛋白免疫抗體效價分別達到1∶5 120，1∶5 120，1∶10 240.

2.5 Western blotting 分析

經Western blot分析，3種融合蛋白分別在36，29，27 kD處出現特異性條帶，而pET-32a空載體及BL21對照未出現特異性條帶，證實表達的融合蛋白與制備的鼠源抗體具有較好的反應原性(圖10～圖12).

圖12 swFcγRIIB1-BY融合蛋白Western blot分析Fig.12 Western blot analysis of the recombinant protein swFcγRIIB1-BY

3 小結與討論

目前已知的抑制性受體有30多種，按結構特征可分為2類:一類屬 C型凝集素超家族(CL SF)，屬Ⅱ型跨膜蛋白，主要包括Ly49家族，NKG2家族和 DCIR等.另一類為免疫球蛋白超家族(IgSF)，大多屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要包括FcγRIIB，Ig樣轉錄物(ILT)、信號調節(jié)蛋白(SIRP)等［13］.FcγRIIB 屬于 I型跨膜蛋白，胞內區(qū)含有一個ITIM酪氨酸抑制基序，FcγRIIB和其他含有ITAM的活化性受體交聯時，胞內區(qū)的ITIM發(fā)生酪氨酸磷酸化后可以結合SHP-1，SHP-2，SHIP等具有2個串聯SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶，并通過后者傳遞抑制信號，在免疫細胞的自我負反饋調節(jié)方面發(fā)揮重要作用，這種抑制作用減弱會導致免疫功能亢進，產生自身免疫病.FcγRIIB屬于低親和力受體，僅能與抗原抗體復合物或多聚IgG結合，相關研究表明豬的FcγRIIB能夠介導PRRSV的ADE作用［13］.目前，諸多研究致力于通過主動干預FcγRIIB的異常表達，尋找治療自身免疫性疾病或腫瘤新的切入點.

在豬的FcγRIIIA中發(fā)現存在胞外區(qū)只有1個Ig結構域的選擇性剪切異構體，且這種剪切異構體不具備結合免疫復合物的功能，然而，這種剪切異構體可以和包含另一結構域的其他選擇性剪切異構體互相作用，促進Fc受體與免疫復合物的結合，并提高 FcγRIII受體產生的信號強度［15］.豬FcγRIIB雖尚未克隆出包含單個Ig結構域的選擇性剪切異構體，但并不排除有這樣的可能性，將swFcγRIIB1 2個Ig結構域進行分段表達并制備抗體，為進一步研究2個Ig結構域在swFcγRIIB1結合免疫復合物的功能中發(fā)揮怎樣的作用，封閉一個Ig結構域后與swFcγRIIB相互作用，是否促進了FcγRII受體免疫復合物的攝取等方面打下基礎.

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