馮 沖，陳 偉，杜風光，宋安東

(1.河南農業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州450002;2.河南天冠集團，河南 南陽473000)

纖維質原料中的骨架木質纖維素結構復雜，纖維素因鑲嵌在由木質素和半纖維素交聯形成的網狀結構中而難以被纖維素酶水解，預處理是纖維質原料改性及提高纖維素酶水解效率的關鍵技術［1］.自然界本身存在能夠降解木質纖維素的微生物如真菌、放線菌和細菌，而真菌是其最重要的類型.一些白腐真菌能產生過氧化物酶(LiP)、錳依賴過氧化物酶(MnP)及漆酶(Lac)等3種木質素降解酶，而大多數白腐真菌僅產生2種甚至1種木質素降解酶［2，3］.目前國內外研究最多、降解木質素能力較強的白腐真菌是黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium).戴永鑫等［4］研究了白腐真菌及其產生的木質素降解酶系對木質素降解的方法，探討了黃孢原毛平革菌和雜色云芝單一菌株生物降解及雙菌株聯合降解木質纖維素的規(guī)律.木質素的降解主要通過多種胞外酶的協同作用實現［5］.這些酶之間也可能存在相互促進或相互阻礙作用，從而影響相關處理效率，為揭示木質素降解酶對纖維素酶水解糖化的影響，本研究利用2株對玉米秸稈木質素具有較強降解能力的白腐真菌(黃孢原毛平革菌和雜色云芝)來探討白腐真菌預處理玉米秸稈對纖維素酶水解糖化的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 供試菌種為黃孢原毛平革菌和雜色云芝，河南農業(yè)大學生命科學學院微生物能源工程實驗室保藏菌種.

1.1.2 試劑和藥品 漆酶 (配制體積分數1%的酶活力為104 U·mL－1)購自諾維信公司;木聚糖酶(酶活力為2×104U·mL－1)購自無錫杰能科生物工程有限公司;纖維素酶 (酶活力為400 U·mL－1)購自無錫星達酶制劑廠.

1.1.3 玉米秸稈粉 玉米秸稈清洗3遍，烘干(105 ℃，4 h以上)，粉碎(100目).

1.1.4 粗過氧化物酶液的制備 參見文獻［6］.

1.1.5 粗漆酶液制備 參見文獻［6］.

1.1.6 液相色譜條件 安捷倫1100，安捷倫碳水化合物 ZORBAX(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，保護柱 (150 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相體積分數為75%乙腈，流速 1.0 mL·min－1，柱溫 30 ℃［7～10］.

1.2 方法

1.2.1 白腐真菌發(fā)酵酶液對纖維素酶水解糖化影響試驗設計 對照(CK):玉米秸稈與10 mmol·L－1pH值為4.5的乙酸 －乙酸納緩沖液按6∶1的液固質量比混合，121 ℃，0.1 MPa高壓處理0.5 h，冷卻后補加緩沖液使液固質量比為10∶1，纖維素酶水解.

A)粗過氧化物酶液的預處理:玉米秸稈與10 mmol·L－1pH值為4.5的乙酸－乙酸納緩沖液按6∶1的液固質量比混合，121 ℃，0.1 MPa高壓處理0.5 h，冷卻后加入30 mL緩沖液和10 mL粗過氧化物酶液，45 ℃，140 r·min－1條件下處理 24 h，纖維素酶水解.

B)粗漆酶液預處理:玉米秸稈與10 mmol·L－1pH值為4.5乙酸－乙酸納緩沖液按6∶1的液固質量比混合，121 ℃，0.1 MPa 高壓處理0.5 h，冷卻后加入30 mL緩沖液和10 mL粗漆酶液在45℃，140 r·min－1下處理 24 h，纖維素酶水解.

C)粗過氧化物酶液和粗漆酶液混合預處理:玉米秸稈與10 mmol·L－1pH值為4.5乙酸－乙酸納緩沖液按6∶1的液固質量比混合，121℃，0.1 MPa高壓處理0.5 h，冷卻后加入20 mL緩沖液和V(粗過氧化物酶液)∶V(粗漆酶液)=1∶1的混合液 20 mL，在45 ℃，140 r·min－1條件下處理24 h，纖維素酶水解.

1.2.2 白腐真菌發(fā)酵酶液對纖維素酶水解微晶纖維素影響試驗設計 對照(CK):玉米秸稈不經預處理直接用纖維素酶進行水解.

A)粗過氧化物酶液預處理后酶解:加粗過氧化物酶液(1 mL·g－1)，45 ℃，140 r·min－1預處理24 h，加纖維素酶水解.

B)粗過氧化物酶液預處理滅活后酶解:加粗過氧化物酶液(1 mL·g－1)后滅活(沸水煮15 min)，45 ℃，140 r·min－1預處理24 h，加纖維素酶水解.

C)粗漆酶預處理后酶解:加粗漆酶(1 mL·g－1秸稈)，45 ℃，140 r·min－1預處理 24 h，加纖維素酶水解.

D)粗漆酶預處理滅活后酶解:加粗漆酶(1 mL·g－1)后滅活(沸水煮 15 min)，45 ℃，140 r·min－1預處理24 h，加纖維素酶水解.

1.2.3 Novozymes漆酶對纖維素濾紙酶活的影響試驗設計 不加漆酶(CK):加纖維素酶反應60 min，測纖維素酶活性.

A)加漆酶:加漆酶0.5 mL，測定對纖維素濾紙酶活力的影響.

B)加滅活漆酶:加滅活漆酶0.5 mL，測定對纖維素濾紙酶活力的影響.

酶活性測定方法為:濾紙條 50 mg，0.1 mol·L－1HAC-NaAC(pH 值為 4.8)緩沖液 1.5 mL 和 0.5 mL稀釋酶液反應60 min后加2 mL DNS.Novozymes漆酶，配制體積分數0.5%，杰能科纖維素酶稀釋1 000倍測濾紙酶活.

1.2.4 Novozymes漆酶對纖維素酶水解糖化的影響試驗設計 A)不加漆酶:纖維素酶直接水解糖化24 h.

B)加漆酶作用后不滅活:體積分數1%漆酶45 ℃，140 r·min－1預處理0和24 h后，纖維素酶水解糖化.

C)加漆酶作用后滅活:體積分數1%漆酶45℃，140 r·min－1預處理0 和24 h 后，滅酶(煮沸15 min)后，纖維素酶水解糖化.

1.2.5 Novozymes漆酶對纖維素酶水解微晶纖維素的影響試驗設計 不加漆酶(CK):直接加纖維素酶水解糖化，液相色譜測糖.

A)漆酶作用后不滅活:體積分數1%的漆酶45 ℃，140 r·min－1預處理 24 h 后，加纖維素酶水解糖化，液相色譜測糖.

B)漆酶作用后滅活:體積分數1%的漆酶45℃，140 r·min－1預處理24 h后，加熱煮沸 15 min滅活，滅活后加纖維素酶水解糖化，液相色譜測糖.

1.2.6 木質素降解酶酶活的測定 參見文獻［11］.

1.2.7 纖維素酶水解糖化條件 按57 U·g－1秸稈添加，pH值為4.8檸檬酸緩沖液，在50℃，140 r·min－1條件下酶解 24 h.

1.2.8 還原糖質量分數測定 參見文獻［12］，其中，還原糖得率/%=還原糖質量分數/底物(秸稈)質量分數×100

2 結果與分析

2.1 白腐真菌發(fā)酵酶液對纖維素酶水解糖化的影響

從表1可以看出，粗過氧化物酶發(fā)酵液預處理玉米秸稈后，還原糖得率降低了40.3%;粗漆酶發(fā)酵液預處理后，還原糖得率降低了3.8%;混合酶發(fā)酵液預處理后，還原糖得率降低了27%.由此可知，白腐真菌發(fā)酵酶液預處理玉米秸稈后對纖維素酶水解糖化均有抑制作用，其中粗過氧化物酶發(fā)酵液影響最大，混合酶發(fā)酵液次之，粗漆酶發(fā)酵液影響最小.

2.2 白腐真菌發(fā)酵酶液對纖維素酶水解微晶纖維素的影響

從表2可以看出，粗過氧化物酶發(fā)酵液預處理玉米秸稈后，纖維素酶水解微晶纖維素所得葡萄糖質量濃度降低了2.7%;滅活后，葡萄糖質量濃度降低了2.3%.粗漆酶發(fā)酵液預處理后，葡萄糖質量濃度降低了2.9%;滅活后，葡萄糖質量濃度降低了1.5%.由此可知，粗過氧化物酶發(fā)酵液和粗漆酶發(fā)酵液預處理玉米秸稈后，對纖維素酶水解微晶纖維素均有抑制作用;滅活后，抑制作用減弱但沒有消除.

表1 白腐真菌發(fā)酵酶液對纖維素酶水解糖化的影響Table 1 The effect of white-rot fungus fermentation broth to cellulose enzyme hydrolysis saccharification

表2 白腐真菌發(fā)酵酶液對纖維素酶水解微晶纖維素的影響Table 2 The effect of white-rot fungus fermentation broth to cellulose enzyme hydrolysis microcrystalline cellulose

2.3 Novozymes漆酶對纖維素濾紙酶活性的影響

從表3可以看出，Novozymes漆酶使纖維素酶濾紙酶活性降低了80.6%;漆酶滅活后，酶活降低了3.2%.由此可知，Novozymes漆酶對纖維素酶濾紙酶活抑制作用明顯;滅活后，對纖維素酶濾紙酶活性的抑制作用大大減弱.

表3 Novozymes漆酶對纖維素濾紙酶活影響Table 3 The effect of Novozymes laccase on filter paper enzyme activity of cellulose

2.4 Novozymes漆酶對纖維素酶水解糖化的影響

從表4可以看出，Novozymes漆酶作用0 h后，還原糖得率降低了30%;漆酶滅活后，還原糖得率降低了28.3%.Novozymes漆酶作用24 h再糖化，還原糖得率降低了27.5%，漆酶滅活后，還原糖得率降低了15.8%.由此可知，Novozymes漆酶對纖維素酶水解糖化有明顯抑制作用.

2.5 Novozymes漆酶對纖維素酶水解微晶纖維素的影響

從表5可以看出，纖維素酶直接水解微晶纖維素所得葡萄糖糖質量濃度為34.3 g·L－1;加入Novozymes漆酶后再水解，葡萄糖質量濃度降低了72.0%;漆酶滅活后，葡萄糖質量濃度降低了64.4%.由此可知，漆酶對纖維素酶水解微晶纖維素有明顯抑制作用，滅活后抑制作用有所減弱，但無法完全消除.

表5 Novozymes漆酶對微晶纖維素的糖化影響Table 5 The effect of Novozymes laccase on saccharification of microcrystalline cellulose

3 結論

1)白腐真菌(黃孢原毛平革菌、雜色云芝)發(fā)酵酶液預處理玉米秸稈后體系對纖維素酶水解糖化有抑制作用，酶滅活后抑制作用減弱.其中粗過氧化物酶液影響最大，混合酶液次之，粗漆酶最小.

2)2個菌種發(fā)酵酶液對纖維素酶水解微晶纖維素均有抑制作用，酶滅活后水解糖化均有所提高，但抑制作用依然存在.其中粗過氧化物酶液較粗漆酶影響大.

3)通過Novozymes漆酶一系列的試驗，進一步證實了漆酶對纖維素酶水解糖化有較大的抑制作用.

［1］ SUN Y，CHENG J Y.Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production:a review［J］.Bioresouree Technology，2002，83(1):1 －11.

［2］ ERIKSSON K E，BLANCHETTE R A，ANDER P.Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components［M］.New York:Springer-Verlag，1990，45:345－347.

［3］ HATAKKA A.Lignin-modifying enzymes from selected white-rot fungi:production and role in lignin degradation［J］.FEMS Microbiology Reviews，1994，13:125－135.

［4］ 戴永鑫，王海寬，劉逸寒，等.白腐菌對秸稈中木質素生物降解的研究［J］.天津科技大學學報，2007，22(4):24－26.

［5］ LLOYD T A，WYMAN C E.Combined sugar yields for dilute sulfuric acid pretreatment of corn stover followed by enzymatic hydrolysis of the remaining solids［J］.Bioresource Technology，2005，96:1967 －1977.

［6］ 宋安東.生物質(秸稈)纖維燃料乙醇生產工藝試驗研究［D］.鄭州:河南農業(yè)大學，2003.

［7］ 盧飛雁.HPLC法測定阿卡波糖發(fā)酵液中葡萄糖的含量［J］.浙江化工，2005，36(8):27 －28.

［8］ 田文禮，籍保平，李 博，等.HPLC法檢測紅茶菌中葡萄糖代謝曲線及培養(yǎng)基的優(yōu)化研究［J］.食品科學，2004，25(2):161 －163.

［9］ 高新蕾，吳 莉.奶粉中糖分的快速測定法［J］.食品科技，2004(4):81－82.

［10］白冬梅，杜國民，沈 菲，等.反相HPLC同時測定產琥珀酸放線桿菌發(fā)酵液中的有機酸與葡萄糖［J］.分析試驗室，2004，23(3):15 －18.

［11］宋安東，張百良，吳 坤，等.雜色云芝產木質纖維素酶及對稻草秸稈的降解［J］.過程工程學報，2005，5(4):414－419.

［12］陳 偉.木質素降解酶預處理玉米秸稈試驗研究［D］.鄭州:河南農業(yè)大學，2008.