劉秀麗，趙 林，劉涉江，游璐華

(天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072)

地下水中苯系物(benzene，toluene ethylbenzene，xylene-volatile aromatic compounds，BTEX)的污染呈逐年累加增重的態(tài)勢，利用微生物修復(fù)苯系物污染地下水的方法已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[1-4]．傳統(tǒng)的微生物修復(fù)技術(shù)存在細(xì)胞易流失、無法重復(fù)利用等缺點(diǎn)，包埋技術(shù)是將微生物包埋于載體骨架中，使其免受有機(jī)污染物的毒害，不僅提高有效生物量、降低細(xì)胞重建的費(fèi)用，而且具有穩(wěn)定的降解性能，已廣泛應(yīng)用于地表水有機(jī)污染物的去除研究中[5-8]．混合菌雖然結(jié)構(gòu)復(fù)雜但種群豐富，能夠高效地去除污染地下水中的BTEX混合物[9]．苯的6個(gè)Π電子處于完全離域狀態(tài)從而形成大Π鍵[10]，對于BTEX來說，苯的化學(xué)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，因此其生物降解的啟動最困難．炭材料應(yīng)用于水體污染治理的研究越來越多[11-14]，活性炭纖維作為一種新型的水處理材料，具有較高的吸附性能、機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性，因此更易于微生物固著，已有將其應(yīng)用于固定化生物降解苯酚的研究[15]．

筆者選取天津大港油田區(qū)長期被石油污染的土壤，對其進(jìn)行有目的的富集馴化，得到能夠降解BTEX的優(yōu)勢混合菌；以海藻酸鈣(calcium alginate，CA)、活性炭纖維(activated carbon fiber，ACF)為包埋載體，實(shí)現(xiàn)混合菌的生物固定化．在確定最佳包埋條件下，對固定化生物小球(immobilized bio-bead，MB)的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描電鏡觀察，并以苯為 BTEX的代表對象，研究了 MB對苯的生物降解性能，進(jìn)一步探討了不同接種量的影響及其可重復(fù)利用性．

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海藻酸鈉(sodium alginate，SA)：分析純；氯化鈣(CaCl2)：分析純；黏膠基活性炭纖維(ACF)氈：比表面積為1,280,m2/g，孔徑為2.0,nm，孔容積為0.9,mL/g，碘吸附值為1,150,mg/g．

包埋所用活性炭纖維：黏膠基纖維氈置于 110,℃烘箱中烘干2,h，經(jīng)研磨過100目篩后備用．

包埋菌源：選取天津大港油田區(qū)長期受石油污染的土壤，對其進(jìn)行好氧富集并采用BTEX混合基質(zhì)進(jìn)行馴化，獲得BTEX優(yōu)勢降解菌．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

筆者制備的新型海藻酸鈣-活性炭纖維生物固定化小球鮮見報(bào)道．選擇海藻酸鈉作為包埋劑，氯化鈣溶液作為交聯(lián)劑．將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的ACF與20,mL含 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的 SA 溶液混合制備成包埋劑，取一定量處于對數(shù)生長期的優(yōu)勢菌液，經(jīng)離心稱重后與包埋劑混合均勻．采用蠕動泵，將上述混合溶液泵入到含4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的CaCl2交聯(lián)溶液中固化成球．

將100,mL培養(yǎng)基置于750,mL自制的密閉生物降解反應(yīng)器內(nèi)，經(jīng)充分曝氣后，加入MB置于轉(zhuǎn)速 150,r/min的恒溫?fù)u床中，降解實(shí)驗(yàn)條件為溫度 30,℃，pH值7.5～8.0．培養(yǎng)基組成如下：KH2PO4為 70,mg/L，K2HPO4為 50,mg/L，(NH4)2SO4為 100,mg/L，MgSO4·7H2O 為 1,mg/L，CaCl2為 1,mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 為3,mg/L，MnSO4·H2O 為 4,mg/L，ZnSO4·H2O 為5,mg/L．為考察 MB可重復(fù)利用性能，待降解實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出 MB，以無菌生理鹽水沖洗多次后重新加入新鮮培養(yǎng)基，苯的加入量相同，以 24,h為周期測定苯濃度變化．

1.3 分析方法

液相中苯的濃度采用氣相色譜外標(biāo)峰面積法測定：Agilent,6890N 氣相色譜儀，配有 FID 檢測器和HP-5型毛細(xì)管柱．分析條件為：柱溫40,℃，進(jìn)樣口溫度 200,℃，檢測器溫度 250,℃，H2流量 40,mL/min，空氣流量 550,mL/min．采用 Philip XL-30型掃描電鏡觀察MB外部和內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)，MB經(jīng)冷凍干燥和鍍金處理后置于掃描電鏡下進(jìn)行觀察．

2 結(jié)果及討論

2.1 MB的微觀結(jié)構(gòu)

采用上述方法所制備的MB，其直徑為2～4,mm．通過掃描電鏡對MB微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示．從圖1(a)中可以看出，MB表面并非光滑致密，ACF均勻分布在其表面；從圖1(b)中可以看出，MB內(nèi)部孔隙緊密均勻、孔徑大小一致；圖1(c)所示是隨機(jī)選取的MB的孔隙，測定其孔徑大小平均為200,μm；圖1(d)所示是局部放大后觀察到的MB內(nèi)部附著的微生物．由此可見，該方法所制備的MB，具有表面通透、孔道致密、孔徑均一的特點(diǎn)，并能為微生物提供足夠的附著空間．此外ACF均勻地分布和鑲嵌在MB的表面和內(nèi)部，不僅增加了MB骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、提高了機(jī)械強(qiáng)度，而且有利于將苯大量吸附到 MB表面，從而加強(qiáng)苯的富集和微生物的進(jìn)一步降解．

2.2 MB強(qiáng)化除苯效果

采用添加和不添加菌體兩種方式分別制備固定化小球，離心13.7,mg菌體混于20,mL包埋溶液中制備成 MB，而 CA-Blank和 CA-ACF-Blank分別作為空白對照，其中CA-Blank指未包埋微生物和ACF的固定化小球，CA-ACF-Blank是指未包埋微生物而添加了 ACF所制備的固定化小球．CA-Blank、CAACF-Blank兩種非生物固定化小球和生物固定化小球MB去除苯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示．圖中C為時(shí)間 t時(shí)液相苯濃度，C0為苯初始濃度．結(jié)果表明：MB在反應(yīng)120,h內(nèi)對苯的去除率達(dá)到80%，而CA-Blank和CA-ACF-Blank的苯去除率分別達(dá)到20%和50%；相同時(shí)間內(nèi)，去除率由大到小的次序?yàn)?MB＞CAACF-Blank＞CA-Blank．此外，反應(yīng)結(jié)束前，CA-Blank的培養(yǎng)基逐漸混濁，少量固定化小球出現(xiàn)溶解破裂．分析認(rèn)為這主要是由于未添加 ACF的 CABlank，其機(jī)械強(qiáng)度較差，在一定鹽度和轉(zhuǎn)速條件下易發(fā)生水溶解體．這也說明 ACF作為包埋載體，不僅起到骨架支撐作用而且能有效改善包埋固定化小球的機(jī)械強(qiáng)度．

圖1 MB掃描電子顯微照片F(xiàn)ig.1 Scanning electron micrographs of MB

對于強(qiáng)化除苯過程來說，CA-Blank和 CA-ACFBlank對苯的去除主要是吸附作用，而ACF作為改性的包埋載體，具有更高的比表面積和孔容積，對苯的吸附能力更強(qiáng)；因此，從苯的去除效果來看，CAACF-Blank較CA-Blank更好．對于MB來說，其強(qiáng)化除苯表現(xiàn)為快速和慢速兩個(gè)階段：反應(yīng)12,h內(nèi)苯的去除率較高，之后趨緩．對上述兩階段苯濃度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，其一級動力學(xué)方程分別為 ln,C＝-0.082,4t +5.148,8(R2＝0.965,6)和ln,C＝-0.012,9t+4.354,9(R2＝0.976 8)，對應(yīng)的速率常數(shù)分別為0.082,4 mg/(L·h)和 0.012 9 mg/(L·h)．比較 CABlank、CA-ACF-Blank和生物固定化小球MB強(qiáng)化除苯的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析認(rèn)為MB對苯的去除主要是吸附作用和生物降解共同作用的結(jié)果．液相中苯的濃度相對較低，CA和ACF載體能夠?qū)⒈酱罅课降組B表面，強(qiáng)化了MB對苯的去除效果．

2.3 接種量的影響

在 20,mL包埋劑溶液中分別加入 13.7,mg、68.8,mg、137.7,mg和413.3,mg離心后的菌體，交聯(lián)成球后加入到100,mL的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行強(qiáng)化除苯的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示．

圖3 不同接種量條件下MB強(qiáng)化除苯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Effects of enhanced biodegradation of benzene by MB under different inoculum densities

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著接種量的增加，MB對苯的去除率依次增大，而去除速率的變化表現(xiàn)為由快速到慢速的兩階段性．采用一級動力學(xué)方程對實(shí)驗(yàn)結(jié)果 進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果見表1．

表1 不同接種量條件下MB強(qiáng)化除苯過程的擬合結(jié)果Tab.1 Fitting results of enhanced biodegradation of benzene under different cell densities

從表1中的擬合結(jié)果可以看出，MB強(qiáng)化除苯的速率常數(shù)均隨接種量的增加而增大．當(dāng)接種量達(dá)到413.3,mg時(shí)，苯的去除率可達(dá)到 100%；但反應(yīng)進(jìn)行40,h左右時(shí)培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色顆粒，反應(yīng) 72,h后形成黑色絮狀體，分析認(rèn)為這主要是由于接種量過大造成菌體迅速增殖，從而導(dǎo)致了 MB微觀結(jié)構(gòu)破壞，使得鑲嵌較為松散的ACF溶出團(tuán)聚所致．可見，接種量過低將導(dǎo)致苯的去除率和去除速率降低，而接種量過大則不利于保持MB的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，最終導(dǎo)致MB有效生物量降低．綜上認(rèn)為，接種量為 137.7,mg時(shí)所制備的MB具有最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和最佳強(qiáng)化除苯效果．

MB強(qiáng)化除苯過程主要包括快速吸附和吸附-降解共同作用兩個(gè)階段，其中第2階段主要以生物降解作用為主．因此可采用該階段一級動力學(xué)常數(shù)計(jì)算包埋微生物降解苯的半衰期[16]，計(jì)算式為

式中 k1為一級降解速率常數(shù)．根據(jù)式(1)計(jì)算得到不同接種量條件下 MB包埋微生物降解苯的半衰期平均值為 64,h，高于游離態(tài) BTEX降解菌的半衰期[17]，這主要是由于MB傳質(zhì)過程不同所致，而采用固定化技術(shù)的確有利于保持微生物活性，避免高濃度底物的毒害作用；此外 MB制備過程選擇 ACF作為改性載體有助于苯大量富集在MB表面，增加微生物與苯的接觸時(shí)間，從而起到了強(qiáng)化除苯的效果．

2.4 MB穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性

為考察MB的可重復(fù)利用性，待強(qiáng)化除苯實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出 MB用無菌生理鹽水沖洗多次，置于初始苯濃度為50,mg/L的新鮮培養(yǎng)基中，測定24,h內(nèi)苯濃度的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示．

在進(jìn)行7個(gè)周期的重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)后，MB球體完好且未出現(xiàn)球體松散和 ACF溶出的現(xiàn)象．從圖 4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在可重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)中，苯的去除過程和去除速率均呈現(xiàn)整體遞減的趨勢而并未出現(xiàn)先吸附后降解的兩階段過程，說明MB的重復(fù)利用實(shí)驗(yàn)中強(qiáng)化除苯的效果穩(wěn)定可靠，而MB至少可以重復(fù)利用8次．因此可以認(rèn)為ACF作為包埋載體能夠改善 MB的骨架結(jié)構(gòu)，提高其機(jī)械強(qiáng)度，從而增加 MB對底物苯的耐受能力，并且添加 ACF的固定化生物小球具備良好的可重復(fù)利用性和工程化潛力．

圖4 MB的可重復(fù)利用性Fig.4 Reusability of MB

3 結(jié) 論

(1) 該方法所制備 MB直徑為 2～4,mm．掃描電鏡結(jié)果表明：MB表面通透，孔道致密，孔徑均一，孔徑大小約為 200 μm；ACF較為均勻地分布在 MB的表面和內(nèi)部．

(2) 結(jié)合CA-Blank、CA-ACF-Blank兩種非生物固定化小球的對照實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，MB強(qiáng)化除苯過程主要包括快速吸附階段和吸附-生物降解共同作用階段；而包埋微生物對苯降解的半衰期要大于游離微生物的降解半衰期．

(3) 接種量不僅影響著 MB微觀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而且直接決定了強(qiáng)化除苯的效果．本研究中的最佳接種量為 6.89 mg/mL(菌體/包埋溶液)．在最佳接種量條件下，MB至少可重復(fù)利用 8次，并且保持球體完整和較好的強(qiáng)化除苯效果．(4) ACF是一種優(yōu)良的包埋固定化載體，不僅能夠改善 MB的骨架結(jié)構(gòu)、提高其機(jī)械強(qiáng)度，而且增加了MB對苯的耐受能力，從而使MB具備良好的可重復(fù)利用性和工程化潛力．

［1］范亞維，周啟星. BTEX的環(huán)境行為與生態(tài)毒理[J].生態(tài)學(xué)雜志，2008，27(4)：632-638.

Fan Yawei，Zhou Qixing. Research advances on environmental behavior and ecological toxicology of BTEX[J].Chinese Journal of Ecology，2008，27(4)：632-638(in Chinese).

［2］Xu Z，Mulchandani A，Chen W. Detection of benzene，toluene，ethylbenzene and xylenes(BTEX)using toluene dioxygenase peroxidase coupling reactions[J].Biotechnology Progress，2003，19：1812-1815.

［3］Mehrdad Fahadian. In situ bioremedation of monoaromatic pollutants in groundwater：A review[J].Bioresource Technology，2008，99：5296-5308.

［4］王 琳，邵宗澤. 4株苯系物降解菌株的篩選鑒定、降解特性及其降解基因研究[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2006，46(5)：753-757.Wang Lin，Shao Zongze. Isolation and characterization of 4 benzene/toluene-degrading bacterial strains and detection of related degradation genes[J].Acta Microbiologica Sinca，2006，46(5)：753-757(in Chinese).

［5］Wiesel I，Wubker S M，Rehm H J. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by an immobilized mixed bacterial culture[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1993，39(1)：110-116.

［6］Shreve C S. Comparison of substrate utilization and growth kinetics between immobilized and detoxification of aromatic compounds[J].Biotechnology and Bioengineering，1993，41：370-379.

［7］Chen Dongzhi，Chen Jianmeng，Zhong Weihong. Degradation of methyl tert-butyl ether by gel immobilizedMethyliBium petroleiphilumPM1[J].Bioresource Technology，2008，99：4702- 4708.

［8］Shim Hojae，Yang Shang-Tian. Biodegradation of benzene，toluene，ethylbenzene，and o-xylene by a coculture ofPseudomonas putidaandPseudomonas fluorescensimmobilized in a fibrous-bed bioreactor[J].Biotechnology，1999，67：99-112.

［9］王 萍，周啟星. BTEX污染環(huán)境的修復(fù)機(jī)理與技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2009，28(2)：329-334.

Wang Ping. Zhou Qixing. Research advances on remediation mechanisms and technologies of BTEX-contaminated environment[J].Chinese Journal of Ecology，2009，28(2)：329-334(in Chinese).

［10］買文寧，顧夏聲. 單環(huán)芳烴生物降解性與化學(xué)結(jié)構(gòu)之間的定量關(guān)系[J]. 鄭州工學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，16(3)：32-37.

Mai Wenning. Gu Xiasheng. Quantitative relationship between biodegradability and chemical structure of mononuclear aromatic hydrocarbon compounds[J].Journal of Zhengzhou Institute of Technology，1995，16(3)：32-37(in Chinese).

［11］Lee K M，Lim P E. Bioregeneration of powdered activated carbon in the treatment of alkyl substituted phenolic compounds in simultaneous adsorption and biodegradation processes[J].Chemosphere，2005，58(4)：407-416.

［12］Miehio I，Akihiro K，Yoko N，et al.Heavy oil sorption and recovery by using carbon fiber felts [J]. Carbon，2002，40(9)：1487-1492.

［13］Lu C，Chung Y L，Chang K F. Adsorption of trihalomethanes from water with carbon nanotubes[J].Water Research，2005，39(6)：1183-1189.

［14］Dosoretz C G，B?ddeker K W. Removal of trace organics from water using a pumped bed-membrane bioreactor with powdered activated carbon[J].Journal of Membrane Science，2004，239(1)：81-90.

［15］尹艷娥，胡中華，李秋瑜. 固定化生物活性炭纖維小球處理苯酚廢水研究[J]. 中國給水排水，2006，22(3)：93-96.

Yin Yan′e，Hu Zhonghua，Li Qiuyu. Study on phenol removal by ACF beads immobilized with microbe[J].China Water & Wastetwater，2006，22(3)：93-96(in Chinese).

［16］顧夏聲．廢水生物處理數(shù)學(xué)模式[M].2版．北京：清華大學(xué)出版社，1993：88-143.

Gu Xiasheng.Mathematical Model in Biological Wastewater Treatment[M]. 2nd ed. Beijing：Tsinghua University Press，1993：88-143(in Chinese).

［17］孫文靜．BTEX降解菌的馴化及其好氧降解規(guī)律的研究[D]. 天津：天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，2009.

Sun Wenjing. Study on the Domestication and Aerobic Biodegradation of BTEX Degrading Bacteria[D]. Tianjin：School of Environmental Science and Engineering，Tianjin University，2009(in Chinese).