謝正成，樓雄珍，姚理武，黃華宏*，林二培，駱文堅(jiān)，陳春梅

（1. 浙江省慶元縣林業(yè)局，浙江 慶元 323800；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；3. 浙江省林業(yè)種苗管理總站，浙江 杭州 310020）

伯樂(lè)樹(shù)ISSR分子標(biāo)記體系的建立

謝正成1，樓雄珍2，姚理武1，黃華宏2*，林二培2，駱文堅(jiān)3，陳春梅1

（1. 浙江省慶元縣林業(yè)局，浙江 慶元 323800；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；3. 浙江省林業(yè)種苗管理總站，浙江 杭州 310020）

從浙江省慶元縣等地采集23份野生伯樂(lè)樹(shù)單株葉片為試驗(yàn)材料，采用單因素對(duì)比試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)研究了模板DNA、Taq DNA聚合酶的用量，以及Mg2+、dNTP、引物濃度和退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響，建立伯樂(lè)樹(shù)適宜的ISSR-PCR擴(kuò)增體系，即20μL體系中含90 ng模板DNA，1×PCR buffer，1.0 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTP，0.5μmol/L引物，0.75U Taq DNA聚合酶，退火溫度為50℃。

伯樂(lè)樹(shù)；ISSR；分子標(biāo)記

伯樂(lè)樹(shù)（Bretschneidera sinensis）又名鐘萼木，屬伯樂(lè)樹(shù)科，是我國(guó)特有的、古老的單種科和殘遺種，零散分布于浙江南部、臺(tái)灣、福建、湖南、湖北、廣東、廣西和四川等省，處于瀕危狀態(tài)，已被國(guó)家列為一級(jí)保護(hù)植物。它在研究被子植物的系統(tǒng)發(fā)育和古地理、古氣候等方面都有重要科學(xué)價(jià)值。同時(shí)，其樹(shù)姿挺拔，花果艷麗，且木材硬度適中，紋理直，結(jié)構(gòu)細(xì)密，是優(yōu)良的園林綠化樹(shù)種和用材樹(shù)種。目前，有關(guān)伯樂(lè)樹(shù)的研究較少，僅限于生物學(xué)特性[1～2]、群落特征[3]、種子貯藏與育苗[4～7]以及組織培養(yǎng)[8～9]等方面，而利用分子技術(shù)對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

Zietkiew icz等于1994年創(chuàng)建的簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（Inter-Simple Sequence Repeat, ISSR）[10]標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定[11]、遺傳多樣性分析[12～13]、指紋圖譜和分子遺傳圖譜構(gòu)建[14～16]等研究。實(shí)驗(yàn)中ISSR標(biāo)記會(huì)受到多種反應(yīng)條件的影響，不同物種對(duì)反應(yīng)的要求也不盡相同[17～18]。因此，在運(yùn)用該技術(shù)進(jìn)行分析時(shí)，首先需要建立效果好且穩(wěn)定的反應(yīng)體系。本文以我國(guó)特有的珍稀瀕危樹(shù)種伯樂(lè)樹(shù)為材料，對(duì)影響ISSR擴(kuò)增效果的主要因素模板DNA、Taq DNA聚合酶的用量，Mg2+、dNTPs、引物的濃度，以及退火溫度進(jìn)行探討，擬建立適用于伯樂(lè)樹(shù)的最佳ISSR-PCR技術(shù)體系，從而為其天然群體遺傳多樣性分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試材為23份野生伯樂(lè)樹(shù)單株葉片，分別編號(hào)為1～23，其中19份取自浙江的慶元、龍泉、景寧、泰順等縣，4份取自江西龍南的九連山，硅膠干燥保存。

1.2 主要儀器與試劑

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在HYBAID公司生產(chǎn)的PCRexpress擴(kuò)增儀上進(jìn)行；電泳儀、電泳槽以及凝膠成像系統(tǒng)由Bio-Rad公司生產(chǎn)。PCR擴(kuò)增所用的Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、10×PCR 緩沖液、M gCl2（25 mmol/L）、dNTPs（各2.5 mmol/L）以及標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA（DL2000）等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；電泳所用主要試劑Tris、瓊脂糖等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 伯樂(lè)樹(shù)DNA的提取及檢測(cè) 采用改進(jìn)后的CTAB微量法提取伯樂(lè)樹(shù)基因組DNA。用NanoDrop微量分光光度計(jì)測(cè)量所提DNA純度和濃度，同時(shí)用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA是否降解。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以來(lái)自浙江慶元的1號(hào)伯樂(lè)樹(shù)葉片DNA為模板，綜合考慮ISSR技術(shù)在銀杏[11]、茶樹(shù)[15]、五針?biāo)蒣17]等植物上各成分的用量，設(shè)定原始反應(yīng)體系：20μL體系中10×PCR 緩沖液2.0μL、Mg2+2.5 mmol/L、dNTPs 0.125 mmol/L、引物0.5μmol/L、Taq 酶1.0 U、DNA 50 ng。

根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以擴(kuò)增較好的通用引物UBC817、823、824、834作為基因組DNA擴(kuò)增引物，采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對(duì)ISSR反應(yīng)體系中的DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物濃度、Taq DNA聚合酶5種主要成分進(jìn)行分析（20μL反應(yīng)體系中各成分優(yōu)化設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)這5種成分開(kāi)展正交優(yōu)化，選用L16（45）正交表，設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。另外，對(duì)影響PCR結(jié)果的退火溫度也進(jìn)行對(duì)比篩選。

擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，退火溫度（依引物而定）40 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 單因素優(yōu)化設(shè)計(jì)方案Table 1 Single factor design for PCR

表2 ISSR-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[L16（45）]Table 2 Orthogonal design for ISSR-PCR

1.3.3 ISSR-PCR產(chǎn)物檢測(cè) 用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取結(jié)果

所提伯樂(lè)樹(shù)DNA的OD260/OD280值為1.80～2.09，表明DNA純度較好。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣孔清晰，條帶完整（圖1），無(wú)RNA污染。因此，本實(shí)驗(yàn)提取DNA質(zhì)量較好，適合用于ISSR-PCR擴(kuò)增。

圖1 8個(gè)伯樂(lè)樹(shù)樣品DNA的電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoresis results of eight DNA samples ofB. sinensis

2.2 模板DNA用量對(duì)ISSR反應(yīng)的影響

從圖2可以看出，實(shí)驗(yàn)中各模板用量都獲得了比較清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物。同時(shí)，隨著DNA用量增大，主要條帶亮度有所增強(qiáng)，且弱帶也逐漸清晰，當(dāng)用量為30～120 ng時(shí)，擴(kuò)增效果相對(duì)理想。

2.3 Mg2+濃度對(duì)ISSR反應(yīng)的影響

Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴(lài)性酶，Mg2+濃度對(duì)其催化活性和催化產(chǎn)物有明顯影響。從圖3可看出，Mg2+濃度在0.625～5.0 mmol/L均有擴(kuò)增產(chǎn)物。濃度為0.625時(shí)，表現(xiàn)部分條帶缺失，在3.125～5.0 mmol/L時(shí)，出現(xiàn)條帶模糊，而在1.25～2.5 mmol/L有較好的擴(kuò)增，但比較發(fā)現(xiàn)1.25和1.875 mmol/L處擴(kuò)增條帶更清晰穩(wěn)定，且比原始反應(yīng)體系中的用量（2.5 mmol/L）低。

圖2 不同模板DNA用量對(duì)PCR反應(yīng)的影響Figure 2 Effect of different concentration of DNA template on PCR

2.4 dNTPs濃度對(duì)ISSR反應(yīng)的影響

dNTPs 是PCR 的原料，濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生影響。圖4顯示：dNTPs 濃度在0.025～0.225 mmol/L時(shí)，都得到了擴(kuò)增產(chǎn)物，但在0.025 mmol/L時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增譜帶部分缺失，在0.2、0.225 mmol/L時(shí)出現(xiàn)條帶模糊，比較而言，在0.1～0.15 mmol/L時(shí)擴(kuò)增條帶更為清晰且穩(wěn)定。

圖3 不同Mg2+濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響Figure 3 Effect of different concentration of Mg2+on PCR

圖4 不同dNTP濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響Figure 4 Effect of different concentration of dNTPs on PCR

2.5 引物濃度對(duì)ISSR反應(yīng)的影響

引物濃度也是影響PCR擴(kuò)增效果的重要因素。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了0.1～0.9μmol/L共9個(gè)梯度。從圖5可看出，在9個(gè)濃度下都得到擴(kuò)增，其中在0.1和0.9μmol/L時(shí)擴(kuò)增不理想，出現(xiàn)部分主要條帶弱且模糊，在0.2～0.8 μmol/L皆得到了4個(gè)主要條帶，且大小一致，而引物濃度為0.4、0.5μmol/L時(shí)表現(xiàn)相對(duì)清晰。

2.6 Taq酶用量對(duì)ISSR反應(yīng)的影響

Taq DNA聚合酶的用量是PCR反應(yīng)中最為重要的影響因子之一，當(dāng)用量過(guò)多易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，而用量太低又得不到擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖6可知，當(dāng)Taq DNA聚合酶的用量為0.25U時(shí)沒(méi)得到擴(kuò)增，而在0.5～2.0U主要條帶都被擴(kuò)增出來(lái)，且大小一致。

圖5 不同引物濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響Figure 5 Effect of different concentration of prime on PCR

圖6 Taq酶用量對(duì)PCR反應(yīng)的影響Figure 6 Effect of different concentration of Taq DNA polymerase on PCR

2.7 ISSR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，同時(shí)考慮ISSR-PCR主要反應(yīng)成分間的交互作用，進(jìn)一步進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。圖7為以UBC817為引物的正交試驗(yàn)結(jié)果。從圖中可看出，處理9、10得到的條帶相對(duì)清晰，雜帶少且穩(wěn)定。而其他處理表現(xiàn)出條帶模糊或缺失，或是出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，都不符合預(yù)期的目標(biāo)。綜合考慮單因素對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果，選擇處理9作為最佳的反應(yīng)體系。

2.8 退火溫度對(duì)ISSR反應(yīng)的影響

除反應(yīng)體系中的各成分外，ISSR-PCR擴(kuò)增程序中的變性、退火、延伸溫度和時(shí)間，以及循環(huán)數(shù)也會(huì)影響PCR結(jié)果，其中以退火溫度的影響較大。圖8所示為引物UBC834在不同退火溫度下的擴(kuò)增結(jié)果。從42.1～56.7℃的14.6℃溫度間隔里，在退火溫度為42.1～46.4℃時(shí)，擴(kuò)增出的一些條帶亮度弱且模糊不清，48.4、50.3℃時(shí)擴(kuò)增出的條帶清晰明亮，而高于52.3℃時(shí)出現(xiàn)條帶模糊且部分條帶缺失。本實(shí)驗(yàn)選擇50℃為引物834的適宜退火溫度。

圖7 正交試驗(yàn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 7 Electrophoresis of orthogonal design PCR products

圖8 不同退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響Figure 8 Effect of different annealing temperature on PCR

2.9優(yōu)化體系的應(yīng)用

利用上述實(shí)驗(yàn)得到優(yōu)化體系對(duì)23份野生伯樂(lè)樹(shù)單株進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖9所示，引物UBC823將所有23個(gè)單株的帶型完全擴(kuò)增出來(lái)，譜帶清晰且穩(wěn)定，表明建立的伯樂(lè)樹(shù)ISSR反應(yīng)體系是有效可靠的。

圖9 引物UBC823對(duì)23個(gè)伯樂(lè)樹(shù)個(gè)體擴(kuò)增的ISSR帶型Figure 9 ISSR profiles generated by prime UBC823 from 23 samples

3 討論

能否得到高質(zhì)量的DNA是成功進(jìn)行分子標(biāo)記分析的關(guān)鍵一步。伯樂(lè)樹(shù)分布僻遠(yuǎn)，野外采樣時(shí)多使用硅膠干燥方法保存，同時(shí)由于其葉片含較多的多糖、多酚等成分，使得高質(zhì)量DNA的獲得存在一定難度。實(shí)驗(yàn)中采取一般的CTAB法提取，不僅抽提效率低，且多數(shù)樣品DNA溶液呈黃褐色，PCR時(shí)得不到擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，需在常規(guī)的CTAB法上作適當(dāng)改進(jìn)，首先在液氮研磨時(shí)須加入一定量的PVP粉末以抗氧化，且轉(zhuǎn)移要迅速，防止材料暴露過(guò)久；其次料液比要控制適當(dāng)，1 m L提取液加40～50 mg樣本即可。

建立穩(wěn)定的ISSR-PCR反應(yīng)體系，一般可采用單因素或兩因素的完全試驗(yàn)設(shè)計(jì)[19～20]，對(duì)各影響因素進(jìn)行單因素多水平的比較研究，也可采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[21～22]，以有效分析不同因素間的交互作用，但缺點(diǎn)是處理水平設(shè)置不宜過(guò)多。本實(shí)驗(yàn)綜合了兩種試驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)，先對(duì)影響PCR結(jié)果的主要反應(yīng)成分進(jìn)行單因素多水平對(duì)比分析，確定各因素水平范圍后，再開(kāi)展正交優(yōu)化試驗(yàn)，獲得了伯樂(lè)樹(shù)適宜的ISSR-PCR擴(kuò)增體系：20μL體系中含90 ng模板DNA，1.0 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTP，0.5μmol/L引物，0.75U Taq DNA聚合酶。

[1] 黃健鋒，陳定如. 珍稀植物伯樂(lè)樹(shù)和半楓荷的生物學(xué)特性及園林應(yīng)用[J]. 廣東園林，2008，30（1）：46－49.

[2] 王娟，劉仁林，廖為明. 伯樂(lè)樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育節(jié)律與物候特征研究[J]. 江西科學(xué)，2008，26（4）：552－555，634.

[3] 喬琦，邢福武，陳紅鋒，等. 廣東省南昆山伯樂(lè)樹(shù)群落特征及其保護(hù)策略[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（2）：377－384.

[4] 喬琦，陳紅鋒，邢福武. 中國(guó)特有珍稀植物伯樂(lè)樹(shù)種子的類(lèi)型和貯藏[J]. 種子，2009，28（12）：25－27.

[5] 李坊貞，劉仁林，劉燕. 伯樂(lè)樹(shù)種子萌發(fā)與根組織分化規(guī)律的研究[J]. 贛南師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，3：95－98.

[6] 伍銘凱，楊漢遠(yuǎn)，龍舞，等. 伯樂(lè)樹(shù)種子育苗試驗(yàn)[J]. 貴州林業(yè)科技，2006，30（4）：39－41，38.

[7] 盧清華，歐斌，賴(lài)福勝，等. 伯樂(lè)樹(shù)播種育苗試驗(yàn)[J]. 林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2007，21（2）：94－95.

[8] 郭治友，龍應(yīng)霞，肖國(guó)學(xué). 鐘萼木的組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 植物生理學(xué)通訊，2007，43（1）：127.

[9] 歐陽(yáng)獻(xiàn)，李火根. 伯樂(lè)樹(shù)組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（28）：1 3484－1 3485.

[10] Zietkiew icz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification [J]. Genomics, 1994（20）：176－183.

[11] 沈永寶，施季森，趙洪亮. 利用ISSR DNA標(biāo)記鑒定主要銀杏栽培品種[J]. 林業(yè)科學(xué)，2005，41（1）：202－204.

[12] 李建輝，金則新，李鈞敏. 瀕危植物長(zhǎng)葉榧群體不同年齡級(jí)遺傳多樣性的ISSR和RAPD分析[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2010，37（1）：104－111.

[13]邱英雄，傅承新，何云芳. 樂(lè)昌含笑不同類(lèi)型鑒定的ISSR-PCR分析[J]. 林業(yè)科學(xué)，2002，38（6）：49－52.

[14] 宣繼萍，章鎮(zhèn)，房經(jīng)貴，等. 蘋(píng)果品種ISSR指紋圖譜構(gòu)建[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2002，19（6）：421－423.

[15] 黃福平，梁月榮，陸建良，等. 應(yīng)用RAPD和ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建茶樹(shù)回交1代分子遺傳圖譜[J]. 茶葉科學(xué)，2006，26（3）：171－176.

[16] Kojima T，Nagaoka T，Nodak K，et al. Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers in Einkorn wheat in relation to that of RFLP markers[J]. Theor Appl Genet，1998（96）：37－45.

[17] 呂艷芳，劉桂豐，姜靜，等. 五針?biāo)膳呷镮SSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 植物研究，2003，23（4）：429－432.

[18] 馮富娟，王鳳友，劉彤. 紅松ISSR-PCR實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)影響因素[J]. 植物學(xué)通報(bào)，2004，21（3）：326－331.

[19] 劉國(guó)彬，龔榜初，羅正榮. 錐栗自然居群ISSR-PCR分析技術(shù)的建立[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2009，26（1）：103－107.

[20]張春平，何平，胡世俊，等. 瀕危植物峨眉野連ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 廣西植物，2009，29（1）：39－43.

[21] 桂騰琴，孫敏，喬愛(ài)民，等. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化果梅ISSR反應(yīng)體系[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2009，26（1）：108－112.

[22] 王錢(qián)潔，秦永華，陳厚彬，等. 香蕉ISSR反應(yīng)體系的建立[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（1）：13－16.

Establishment of ISSR-PCR Reaction System for Bretschneidera sinensis

XIE Zheng-cheng1，LOU Xiong-zhen2，YAO Li-wu1，HUANG Hua-hong2，LIN Er-pei2，LUO Wen-jian3，CHEN Chun-mei1
（1. Qianyuan Forestry Bureau of Zhejiang, Qianyuan 323800, China; 2. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 3. Zhejiang Forestry Seed and Seedling Administration, Hangzhou 310020, China）

The aim of this study was to establish and optim ize the amp lification system of ISSR-PCR forBretschneidera sinensis. 23 samples ofB. sinensisleaf were collected from Qingyuan of Zhejiang province for the test. The influencing factors of ISSR-PCR, such as DNA template, Taq DNA polymerase, M g2+, dNTPs, primer and annealing temperature were optim ized by test of single factor and orthogonal design. The results indicated that suitable ISSR-PCR system forB. sinensiswas established, namely 20 μL reaction system containing 90 ng template DNA, 1×PCR buffer, 1.0 mmol/L M g2+, 0.15mmol/L dNTPs, 0.5 μmol/L primers, 0.75U Taq DNA polymerase. The optimal annealing temperature was 50℃。

Bretschneidera sinensis; ISSR; marker system

S718.4

A

1001-3776（2011）01-0011-05

2010-07-06；

2010-11-17

浙江省重大科技專(zhuān)項(xiàng)“浙江省珍稀瀕危林木種質(zhì)資源收集保存與利用關(guān)鍵技術(shù)研究及基因庫(kù)建設(shè)”（2006C12059-4）和浙江省科技重點(diǎn)項(xiàng)目“浙江省珍稀瀕危樹(shù)種現(xiàn)代保育關(guān)鍵技術(shù)研究”（2006C22064）

謝正成（1964－），男，浙江慶元人，高級(jí)工程師，主要從事森林培育研究；* 通訊作者。